肿瘤型丙酮酸激酶的原核表达及抗体的制备的中期报告.docxVIP

肿瘤型丙酮酸激酶的原核表达及抗体的制备的中期报告 本实验旨在原核表达人类肿瘤型丙酮酸激酶（TKTL1）并制备其多克隆抗体。本次报告为实验中期报告，主要介绍实验进展情况及遇到的问题。 1. 实验进展情况 （1）构建原核表达载体 我们使用基因合成技术合成了TKTL1基因，并克隆进入pET28a载体。进行PCR和测序验证后发现，TKTL1基因已成功构建进入pET28a载体。 （2）表达TKTL1 将含有TKTL1的pET28a载体转化至大肠杆菌B121(DE3)中，通过IPTG诱导表达TKTL1融合蛋白。我们进行了多组实验，不同的IPTG浓度和时间，结果发现，在IPTG浓度为0.5 mM，诱导时间为5小时的条件下，菌体中TKTL1表达量最高。并且，我们利用SDS分析表达菌体中的融合蛋白大小，确认融合蛋白的分子量是约为78kD，符合预期值。 （3）制备抗体 首先，我们将纯化的融合蛋白作为兔子的抗原，注射至两只新西兰白兔的背部。然后通过ELISA检测抗兔IgG的滴度，筛选出滴度最高的抗体。但是，目前仍需要继续优化ELISA实验条件，以获得更好的抗体滴度。 2. 遇到的问题 （1）IPTG浓度和时间的确定 我们在对菌体的TKTL1表达条件进行优化时遇到了一些问题。首先，IPTG的浓度和诱导时间对表达量有较大影响，因此需要进行优化。我们进行了多次实验，每次结果不尽相同。此外，实验中发现菌体的生长状态也会影响表达情况。我们正在进一步研究这些影响因素。 （2）ELISA实验条件的优化 我们在进行抗体筛选时发现，当前ELISA实验的抗体滴度较低。我们正在对ELISA实验条件进行优化，包括抗原浓度、抗体浓度等因素的优化，期望能得到更好的实验结果。 3. 下一步计划 （1）确定最佳表达条件 继续优化IPTG浓度和诱导时间的条件，以获得最佳TKTL1表达量。 （2）制备并纯化抗体 通过对ELISA实验条件的优化，获得更好的抗体滴度，最终制备出高效的多克隆抗体。 （3）鉴定抗体效价 通过Western blot等手段对制备出的抗体的效价进行鉴定。确定该抗体和TKTL1融合蛋白的特异性结合情况，为后续相关实验提供支持。