实验九血清胆固醇测定（胆固醇氧化酶法）.docVIP

实验九血清胆固醇测定（胆固醇氧化酶法） 实验十四 血清胆固醇测定 (胆固醇氧化酶法) 胆固醇的测定方法很多;通常可分为化学试剂比色法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法五大类。化学试剂比色法中有直接法和间接法;前者可用血清直接测定，后者是用溶剂或其它方法提取胆固醇后再作定量。酶法由于操作简便、结果准确，试剂无腐蚀性，而且因使用特异性酶，大大减少了血液中其它成分的干扰，目前已成为测定胆固醇的主要方法。 【目的】 1(了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理，能进行血清胆固醇测定的操作。 2.掌握血清胆固醇测定的临床意义。 【原理】 血清中总胆固醇(TC)包括胆固醇酯(CE)和游离型胆固醇(FC),酯型占70%，游离型占30%。胆固醇酯酶(CEH)先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸(FFA)，胆固醇在胆固 4醇氧化酶(COD)的作用下氧化生成Δ-胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶(POD)催化氢与4-氨基安替比林(4-AAP)和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下: CEH胆固醇酯胆固醇 ， 脂肪酸 COD胆固醇 ， O42?-胆甾烯酮 ， HO22 POD2HO ， 4-氨基安替比林 ， 酚22红色醌亚胺 【器材】 试管、吸管、试管架、微量加样器、恒温水浴箱、分光光度计。 【试剂】 酶法测定胆固醇多采用市售试剂盒。 1. 酶应用液 胆固醇酶试剂的组成为: pH6.7磷酸盐缓冲液 50mmol/L 胆固醇酯酶 ?200U/L 胆固醇氧化酶 ?100U/L 过氧化物酶 ?3 000U/L 4-氨基安替比林 0.3 mmol/L 苯酚 5 mmol/L 此外还含有胆酸钠和Triton X-100，胆酸钠是胆固醇酯酶的激活剂，表面活性剂Triton X-100能促进脂蛋白释放胆固醇和胆固醇酯，有利于胆固醇酯的水解。 2( 5.17 mmol/L(200mg /dl)胆固醇标准液 精确称取胆固醇 200mg溶于无水乙醇，移入100ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度(也可用异丙醇等配制)。 【操作】 取试管3支，编号，按下操作。 表3-15 酶法测定血清胆固醇操作步骤 加入物(ml) 测定管 标准管 空白管 血清 0.02 , , 胆固醇标准液 , 0.02 , 蒸馏水 , , 0.02 酶应用液 2.00 2.00 2.00 混匀后，37?水浴保温15分钟，在500nm波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。 【计算】 测定管吸光度× 5.17血清胆固醇 (mmol/L) , 标准管吸光度 【注意事项】 1. 黄疸血清过高的胆红素可还原—部分反应中的HO，降低显色反应，使结果偏低。22 但测定胆固醇，胆红素对酶法的干扰比化学法小。 大，故目前提倡采用胆固醇定值血清为标准。 2. 用胆固醇标准液引起的误差较 3. 轻度溶血对测定结果无影响，但明显溶血可使结果增高，此时可用一个不加COD的空白管从结果中减去后纠正。 4. 其它影响因素，如维生素C、谷胱甘肽、氟化物引起负偏差。 【正常参考范围】 3.10,5.70mmol/L 【临床意义】 1. 血清胆固醇增高 常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症、糖尿病、肾病综合征、 胆管阻塞、甲状腺功能减退。 2. 血清胆固醇降低 常见严重贫血、甲状腺功能亢进、长期营养不良等。 【结果及分析】 【思考题】 1(胆固醇有哪些重要的生理功能，血清胆固醇升高对机体最严重的危害是什么, 2(胆固醇在体内可转变为哪些物质，如何排泄, 3(实验中需要哪几种酶参加，各有什么作用,