生化实验细胞冻存和复苏.pdfVIP

培培养养细细胞胞的的冻冻存存和和复复苏苏 • 细胞低温冷冻贮存是细胞培养室的常规工 作。 • 细胞冻存与细胞传代保存相比可以减 人力、经费，减 污染，减 细胞生物学 特性变化。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 • 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化： • 细胞器脱水，细胞 可溶性物质浓度升高，并在 细胞内形成冰晶。 • 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不 致产生大的冰晶。否则形成大结晶。 • 大结晶会造成细胞膜、细胞器损伤和破裂。 • 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰 晶，即冰晶的重结晶。 第一节 细胞冻存 低温保护剂的应用 • 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高 冻存效果。 • 常用的低温保护剂是DDMMSSOO， 是一种渗 透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞 膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过 程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外， 在细胞外形成冰晶，细胞内冰晶减少，从 而减少对细胞的损伤。 细胞冻存方法 • 1.预先配制冻存液：含2200%%血血清清培培养养基基 • 1100%%DDMMSSOO • 2.取对数 长期细胞，经胰酶消化后，加入适量 冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液 （1×10 ～56 ×10细胞/ml)6 • 3.加入1ml细胞于冻冻存存管管中，密封后标记冷冻细 胞名称和冷冻日期。 • 4. 1年后，存活率可达80％一90％。DMSO液用 培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。 对人造血干细胞的研究证 慢冻程序 •标准程序： • 当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min • 当温度达-25℃以下时，5～10℃/min • 当温度达-100℃时，可迅 放入液氮中 • • 简易程序： • 将将冷冷冻冻管管 （（管管口口要要朝朝上上））放放入入纱纱布布袋袋 内内，，纱纱布布袋袋系系以以线线绳绳，，通通过过线线绳绳将将纱纱布布袋袋 固固定定 液液氮氮罐罐罐罐口口，， • 按按每每分分钟钟温温度度下下降降11～～22 ℃℃的的速速度度，，在在4400分分 钟钟内内降降至至液液氮氮表表面面，，停停3300分分钟钟后后，，直直接接投投 人人液液氮氮中中。。 • 冻存过程： • 1. 4℃冰箱4小时 液氮容器的气相液氮1小时 液相液氮 （-196℃）中冻存， • 2. 细胞冻存 放置于-80℃冰箱或干冰中，经过2-3 小时 液氮液相内。 （实验室常用） • 1年后，存洁率可达80％。 • DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤 害细胞。 把细胞放到程序降温盒内， 把程序降温盒放到-80℃的 冰箱里，盒内温度就会成 线性下降。保护细胞不 损伤。 提供可重复的-1℃/分钟的 冷冻率。仅需要100%异丙 醇和机械式冷冻机。 • CCyyaaggeennOOrriiCCeellllTTMM无无蛋蛋白白非非程程序序冻冻存存液液，， 直直接接放放-80℃. 第二节 细胞的复苏和运输 • 一一、、复复苏苏 • 冻冻存存细细胞胞的的复复苏苏以以快快速速融融化化为为原原则则。。 尽尽快快度度过过冰冰晶晶期期 细胞复苏方法 （（ll））从从液液氮氮中中取取出出冷冷冻冻管管，，迅迅速速投投入入3377～～3388 ℃℃ 水水浴浴中中，，使使 融融化化 （（11分分钟钟左左右右））。。 • （（22））55分分钟钟内内用用培培养养液液稀稀释释至至原原体