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细胞培养基本技术;;;下风口;超净工作台和CO2培养箱;解剖显微镜;血清（天然成份）：;细胞培养用器皿的清洗和消毒; 细胞培养(cell culture)是指细胞的离体培养，是在无菌条件下，把动物或植物的细胞从机体中分离出来，置于培养皿中，并在一种合适的环境中，给以营养物质，使之继续生存和繁殖的措施。; 原代培养(primary culture)，或称为初代培养，就是从供体取下组织细胞后在体外进行的首次培养，半途不分割培养物。常用的原代培养措施有组织块培养法和消化培养法。;传代培养 （Secondly Culture）;细胞培养：使用单个细胞悬液 组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫;培养细胞的类型;贴附型细胞的生长特征;正常培养细胞的生长曲线;培养细胞生长的条件; 细胞培养用液的配制 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml;消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超出一定程度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 ;培养基;合成培养基; 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 ;血清中具有： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ； ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤多种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成份;一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞能够维持细胞不死 对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对???清中的复杂成份至今还未完全清楚． 血清中不但存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长克制因子或毒性因子，所以在含血清培养基中培养的细胞所反应的生物学特征是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因体现调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．;血清质量好坏是试验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最佳。 优质血清的原则：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌;抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以克制可能存在的细菌的生长。 一般是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——以便、广谱、稳定;完全培养基的构成;培养基的配制;;吸去旧液;细胞的传代培养：贴附型;细胞的传代培养：贴附型;吸去旧液;细胞的传代培养：悬浮型;无菌操作注意事项;细胞冻存和复苏;冻存和复苏的原则：慢冻快融;慢冻程序;低温保护剂的应用;细胞冻存措施;细胞复苏措施;细胞计数;培养细胞活力测定;2台盼蓝法;3 四唑盐（MTT）比色法;操作环节 （1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％ CO2培养箱中培养一段时间（根据试验目的决定培养时间） （2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。 （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。 （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。统计成果，绘制;试验环节细胞培养基本技术;;;下风口;超净工作台和CO2培养箱;解剖显微镜;血清（天然成份）：;细胞培养用器皿的清洗和消毒; 细胞培养(c