2011生化实验课件蛋白质含量测定.pdfVIP

引言 蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学 科最常涉及的分析内容，是临 诊断疾 病及检查康复情况的重要指标，也是许多 生物制品，药物、食品质量检测的重要指 标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进 行准确可靠的定量分析，则是经常进行的 一项非常重要的工作。 • 目前测定蛋白质含量的方法有很多种， 下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋 白质测定方法： • 物理性质：紫外分光光度法。 • 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法等。 • 染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。 • 其他性质：荧光法。 一、凯氏定氮法： 根据蛋白质的含氮量来 测定蛋白质的含量 :每g样品中含氮克数 ×6.25 ×100 二、比色法：利用蛋白质与不同试剂的呈色反应， 测定蛋白质的含量，如双缩尿法和酚试剂法 （lowry’s method）。 三、紫外分光光度法：利用蛋白质对280nm紫 外光有最大的吸光度而采用 实验目的 •掌握蛋白质含量测定的原理和方法 •学会标准曲线的绘制 •熟练使用分光光度计、紫外分光光 度计。 实验内容 （一）双缩脲法 （二） Lowry法 （三）紫外分光光度法 【实验原理】 •蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液 中能与铜离子形成紫色络合物 （双 缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白 质的含量成正比，因此可用于蛋白 质的定量测定。 • 但必须注意，此反应并非蛋 白质所特有，凡分子内有两个或 两个以上的肽键的化合物以及分 子内有H N—CH＝NH -CH - 2 2 NH2等结构化合物，双缩脲反应 也呈阳性。 • 【实验材料】 • 1．分光光度计 • 2 ．试剂 1 标准牛 清蛋白溶液 10 mg/ml 2 双缩脲试剂： 【实验方法】 • 1.取12支试管分成两组，编号，分别加入0，0.2， 0.4，0.6，0.8，1.0 ml标准牛 清蛋白溶液 , 用水补足到1ml。 • 2.加入双缩脲试剂4 ml，混匀。室温放置30 min。 • 3.以管1 （空白管）调零，在540 nm的波长下进行 比色，分别记录各管的吸光度读数。 • 4.取两组平均值，以蛋白含量为横坐标，光密度 值为纵坐标，绘制标准曲线。 • 5.用同样方法测定未知样品。 【计算】 • 蛋白含量 722型分光光度计的使用 • （1）预热仪器 将选择开关置于 “T”，打 开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防 止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器 时和不测定时应将试样室盖打开，使光路 切断。 （2 ）选定波长 根据实验要求，转动波长 手轮，调至所需要的单色波长。 722型分光光度计的使用 • （3）固定灵敏度档 在能使空白溶液很好 地调到 “100%”的情况下，尽可能采用灵敏 度较低的挡，使用时，首先调到 “1”挡，灵 敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变灵敏 度后，须重新校正 “0%”和 “100%”。选好的 灵敏度，实验过程中不要再变动。 （4）调节T=0% 轻轻旋动 “0%”旋钮，使数 字显示为 “00.0”，（此时试样室是打开 的）。 722型分光光度计的使用 • （5 ）调节T=100%