土壤总DNA提取方法.docxVIP

土壤总DNA的几种提取方法 SDS高盐法（方案1）具体步骤： 称取1g土壤，放入研钵中，倒入适量的液氮，立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨，重复3次，使土壤颗粒研成粉末；将13.5ml提取缓冲液（0.1mol/L磷酸盐[pH=8.0],0.1mol/LEDTA[pH8.0],0.1mol/LTris-HCl[pH8.0],1.5mol/LNaCl,1.0%CTAB）和50pl蛋白酶K（10g/L）与5g土壤置于50ml的离心管中，放入37°C恒温摇床上,225r-min-1振荡30min;加入1.5ml20%SDS，轻轻混匀,65C水浴加热2h，每隔15?30min轻轻摇匀1次;5000r-min-1离心10min，将上清液转入新的50ml离心管中;取4.5ml提取缓冲液加入原离心管，摇匀泥浆，加入0.5ml20%SDS,65C水浴15min，用上述同样的离心速度离心10min，将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1次；用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000r-min-1离心20min;收集上清液，并加入0.6倍体积的异丙醇，室温静置1h;25C下12000r-min-1离心20min，倒出上清液，十燥后加入500pl去离子水，溶解粘附于离心管壁的DNA及其杂质，并收集于1.5ml的微型离心管中. 变性剂加SDS高盐法（方案2）具体步骤： 取1g土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合，加入1ml变性剂（4mol/L异硫青酸胍,10mmol/LTris-HCl[pH7.0],1mmol/LEDTA[pH8.0],0.5%2-筑基乙醇）；液氮冰冻,研磨至溶解，重复3次；转入50ml离心管中，加入9ml提取缓冲液（0.1mol/L磷酸钠[pH7.0],Tris-HCl[pH7.0],0.1mol/LEDTA[pH8.0],1.5mol/LNaCl,1%CTAB,2%SDS）;65C水浴1h,每10min轻轻混匀1次;5000r-min-1离心10min,取上清;在原管中加入5ml提取缓冲液,混合后,65C水浴10min，离心，取上清，合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5000r-min-1离心20min，取上清;加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀1h;20?25C,12000r-min-1离心20min,TE溶解沉淀. SDS-酚氯仿抽提法（方案3）称取1g土壤样品，加入1ml0.1mol/lPH8.0磷酸缓冲液，玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg，使终浓度为2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min,加125pl20%SDS振荡处理15min，离心，分装EP管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h,离心，70%乙醇清洗，200plTE溶解。 冻融溶菌酶SDS裂解法（方案4）取1g土壤样品，加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液（100mmol/LTris-HCl,100mmol/LEDTA,200mmol/LNaCl,1.0%PVP,2.0%CTAB,PH8.0）,加玻璃珠旋涡5~10min，在液氮中冷却1min后迅速在沸水中煮2min，如此重复3次，13000r/min离心10min。上清夜快速置于冰上备用，沉淀用于进一步裂解。将上述沉淀悬浮于0.2ml提取缓冲液中，旋涡10min，加入溶菌酶（100ml/l）50以轻轻混匀后，37C温浴30min，再加入250plSDS缓冲液（100mmol/lTris-HCl,200mmol/lNaCl,2.0%SDS,PH8.0）,上下颠倒10min，13000r/min离心10min,收集上清夜。 二、DNA纯化葡聚糖-200凝胶G离心层析纯化取2ml灭过菌的一次性塑料注射器，用注射器推杆将灭过菌的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度约为0.5cm，然后向注射器筒中加入TE缓冲液浸透的葡聚糖凝胶G-200，制成简式离心层析柱，再置于10ml的离心管中，于高速冷冻离心机上以3000r/min离心20min，去除葡聚糖凝胶G-200中的TE缓冲液，将离心层析柱再置于另一10ml的离心管中，在离心层析柱顶部加入50pl粗土壤DNA，以10min为周期于3000r/min离心，分别收集层析液。层析液浓缩至50pl三、DNA的琼脂糖凝胶电泳证明存在DNA。 四、DNA的纯度和定量检测用紫外分光光度计测量纯化后的DNA溶液在波长为230nm、260nm、280nm下的OD值，分别算出A260/A230及A260/A280值。来估计DNA的纯度。 五、纯化后土壤DNA的PCR扩增PCR反应体系为50pL,模板为1pL。PCR反应引物（放线菌通用引物）： 反应条件：94°C3min预变性；94°C1min,56°C1min