鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤(1).docVIP

鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序 生物安全警告：所操作菌为条件致病菌，请按二级生物安全水平操作，转移和操作活菌时更要注意。处理大量菌株，请在生物安全柜中进行。以正确方式对接触培养物的塑料制品和玻璃制品进行消毒或丢弃。 开始操作之前，请阅读所有指导。把所有接触过细胞悬液或凝胶块的塑料制品、玻璃制品、吸管、小铲等当作污染材料，按照实验室的生物要求丢弃或消毒。可重复使用的制胶模具须在清洗前消毒；可丢弃的制胶模具及胶带和用来把凝胶块从样品孔中推出的小片，应该用10%漂白剂消毒30分钟以上，然后清洗和重复使用。 提前准备 从检测培养基上挑取单菌落，接种于营养琼脂平板（或相当的培养基）上培养；用同一个接种针/环，穿刺或接种于小螺帽管中半固体培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。37℃培养14-18小时。 第一天 1、 打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。 2、 用TE缓冲液（具体试剂配制方法见附件）制备1%Seakem Gold：1%SDS琼脂糖，以配制25ml体积为例说明，方法如下： 1） 准确称取0.25g SeaKem Gold agarose, 放入250ml的蓝色瓶内。 2） 加入22.5ml TE缓冲液，轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开。 3） 微松瓶盖，将玻璃瓶放于微波炉内高火加热30秒，取出轻柔摇荡，再次加热30秒，重复操作直至琼脂彻底溶解（无颗粒物、悬浮物，透光均一，无明显异常折光，无气泡）。 4） 将溶解的SeaKem Gold agarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml，置于56℃水浴箱备用。 3、 在Falcon 2054管（或其他相当的管）上标记样品名称和空白对照；在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称。 4、 在Falcon 2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB（配制方法见附件）。 注：使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同。 5、 用CSB湿润棉签，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中。通过加入CSB稀释或增加菌量提高浓度，调整细胞悬液浓度至指定范围。 用比浊仪（bioMerieux Vitek colorimeter）测其浓度，并调整浓度至3.0-3.5麦氏单位。 注：在3.0~3.5该范围内细菌的浓度都可得到较满意的实验结果，但过大的浓度差距会造成同一块胶上的条带亮度差异，影响条带的识别。 6、 取400μl细菌悬浊液于相应的1.5ml微量离心管中，置于37℃水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备完毕。 7、 从水浴箱中取出微量离心管，每管加入20μl蛋白酶K（储存液浓度20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml，蛋白酶K置于冰上备用。 注：蛋白酶K的终浓度是指在加入400μl琼脂后的浓度。 8、 加入400μl的1%Seakem Gold：1%SDS到上述装有400μl细菌悬液的微量离心管内，用枪头轻轻混匀，避免有气泡产生。（此时1%Seakem Gold：1%SDS 需置于56℃水浴中） 注：没有用完的Seakem Gold agarose可放于室温，并可重复使用1-2次。再溶时，加热时间缩短到每10-15秒一次，直至完全溶解。 9、 迅速将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。为节省时间也可以在4℃下凝固5分钟。 10、记录好模具内对应样品的名称。 细菌的裂解 1、 在50ml离心管上做好样品标记。 注：相同菌株的胶条可以同时放于同一个管中裂解，最多不要超过4条。 2、 配制细胞裂解液CLB （配制方法见附件），然后向每5ml细胞裂解液加入25μl 蛋白酶 K（20mg/ml），使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。 注：蛋白酶K要置于冰上，配制好的蛋白酶K/CLB混合液也要置于冰上。建议配制总量后进行分装。 3、 每个离心管加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。 4、 如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。打开可重复利用模具，用小铲将胶块推入上述裂解混合液中。保证胶块在液面下，而不在管壁上。 注：剩余的菌液以及其它使用过的器具应丢弃并消毒。可重复利用模具需要浸于泡腾片消毒液中15分钟，然后清洗干净。 5、 将离心管放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约130转/分钟。确认水浴箱内液面高于离心管内裂解混合液的液面。 6、 将纯水和TE放在50℃水浴箱中预热。 清洗胶块 1、 调低水浴摇床的温度至50℃。 2、 从水浴摇床中拿出装有胶条的离心管，盖上滤盖，轻轻倒掉CLB，在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。 注：可将离心管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排净。随后的操作中也如此。 3、 每管中加入10ml预热的TYPE ONE WATER