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实验八 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
一 实验目的
学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
二 实验原理
考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合,这种结合具有高度的敏感性。考马斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色,最大吸收峰在465nm当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为595nm,考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。
在一定范围内,考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后,在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系,故可以用于蛋白质浓度的测定。
三 实验器材
(1)旋涡混合器。
(2)试管1.5cm×15cm(×8)
(3)吸管0.10ml(×1),0.50ml(×2),1.0ml(×2),2.0ml(×1),2.0ml(×1)。
(4)722型(或7220型)分光光度计。
(5)容量瓶1000ml(×1)。
(6)量筒100ml(×1)。
(7)电子分析天平。
四 实验试剂
1、9%NaCL溶液。
2、标准蛋白液;牛血清白蛋白(0.1mg/ml),准备称取牛血清白蛋白0.2g,用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000ml。
3、染液:考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中,再加入100ml浓磷酸,后加蒸馏水定容到1000ml。
4、样品液:取牛血清白蛋白(0.1mg/ml)溶液,用0.9%NaCl稀释至一定浓度。
五 实验方法
(一)标准曲线的制备
1、取7支干净试管,按表15进行编号并加入试剂。
2、混匀,室温静置3min,以第1管为空白,于波长595nm处比色,读取吸光度,以吸光度为纵坐标,名标准液浓度(ug/ml)作为横坐标作图得标准曲线。
表15 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的制备
试剂 管号
1(空白)
2
3
4
5
6
7
标准蛋白液/ml
0.9%NaCl/ml
考马斯亮蓝染液/ml
蛋白质浓度(g/ml)
A595nm
—
1.0
4.0
0
0.1
0.9
4.0
10
0.2
0.8
4.0
20
0.3
0.7
4.0
30
0.4
0.6
4.0
40
0.6
0.4
4.0
60
0.8
0.2
4.0
80
(二)样品的测定
另取一支干净试管,加入样品液1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml,混匀,室温静置3min,于波长595nm处比色,读取吸光度,由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
注意
样品蛋白质含量应在10-100ug为宜。一些阳离子如K+ 、Na+、Mg+、乙醇等物质对测定无影响,而大量的去污剂如SDS等会严重干扰测定。
六 注意事项
研究表明,NaCl、KCl、MgCl2、(NH4)SO4、乙醇等物质对测定无影响,而大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定,少量的去污剂及Tris、乙酸、2-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA有少量干扰,可很容易地通过用适当的溶液对照而消除。同时注意,比色应在显色2min-1h内完成;如果测定很严格,可以在试剂加入后的5-20min内测定吸光度,因为在这段时间内颜色最稳定。
测定那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质,有一定误差,因为不同的蛋白质与染料结合量是不同的,故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
待测溶液中蛋白质浓度不可过高或过低,应控制在100-800ug/ml为宜。
七 思考题
Bradford法测定蛋白质含量的原理是什么?应如何克服不利因素对测定的影响?
为什么标准蛋白必须用凯氏定氮法测定纯度?
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