应用二代测序技术进行胚胎植入前遗传学筛查及诊断的基本原理.docxVIP

应用二代测序技术进行胚胎植入前遗传学筛查及诊断的基本原 LI Li-li;SUN Nan;ZHANG Wen-xin 【摘要】辅助生殖技术的发展已帮助越来越多不孕不育的夫妇解决生育难题，而胚 胎植入前遗传学筛查(PGS)及胚胎植入前遗传学诊断(PGD)进一步排除了存在遗传 缺陷的胚胎，并选择健康胚胎进行植入，从而极大降低了新生儿患遗传性疾病的概率. 这两项技术最初采用基于分子杂交或聚合酶链式反应(PCR)的检测方法，随后微阵列 技术也被应用其中.随着人类基因组计划的完成,DNA测序技术进入高速发展的阶 段,二代测序(NGS)采用鸟枪法为基本测序策略，结合生物信息学工具，以高通量、较 低成本、检测项目覆盖面广、自动化程度高、可检测未知片段等优势，正不断扩大 在PGS/PGD中的应用，同时也对辅助生殖技术产生了深远的影响. 【期刊名称】《中国医学装备》 【年(卷)，期】2019(016)007 【总页数】8页(P7-14) 【关键词】二代测序技术;胚胎植入前遗传学筛查;胚胎植入前遗传学诊断 【作者】LI Li-li;SUN Nan;ZHANG Wen-xin 【作者单位】;; 【正文语种】中文 【中图分类】R394-3 遗传学和基因组学的快速发展对人类生命健康及繁衍的影响日益深远，对多种常见 和罕见疾病的研究有助于对应预防、检测及治疗方法的开发，从而提高患者及其家 人的生活质量。在不孕不育等问题日益严峻的情况下，辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)应运而生并被采用于个性化的生育治疗策略， 帮助受生育难题困扰的家庭。其中，植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening，PGS)主要针对高龄、反复助孕失败、反复自然流产等患者，进行植入 前胚胎的染色体畸变检测，用于筛查和丢弃染色体畸变的胚胎，保证受孕者所植入 的胚胎具有正常染色体组的同时，解决因胚胎染色体畸变而导致的植入失败和反复 流产现象，并提高妊娠率［1-2］；植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)则主要针对父母本已患有明确遗传病或携带其致病基因，在种植 前对胚胎进行相应遗传学诊断，主要包括单基因遗传病和染色体病(如罗氏易位、 平衡易位等)，通过选择无致病因素的胚胎进行植入，以提高生育健康婴儿的概率 ［3］。 1990年，Handyside等［4］首次使用基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术的PGD对可能携带X-染色体连锁致病基因的胚胎进行性别 选择。经过不断的发展，当前应用于PGD的PCR技术主要包括逆转录PCR、巢 式PCR、荧光以及实时荧光定量PCR等，主要用于鉴定胚胎特定基因的点突变、 小片段缺失或插入等。但PCR技术的主要问题在于通量低、样品易被污染、扩增 失败和等位基因脱扣(allele drop-out，ADO)等，因此准确性波动大，且检测效 率低［5］。而等位基因脱扣是PCR乃至二代测序(next-generation sequencing， NGS)(基于NGS的PGD基本需要进行多重PCR)中最难以解决的问题，具体指在 两个等位基因中的一个扩增完全，而另一个扩增失败，发生率约为5% ~15%,其 原因可能包括欠佳的PCR环境、细胞裂解不完全、DNA降解、某片段鸟嘌呤和胞 嘧啶(guanine and cytosine , GC)含量值高等［6-7］。PCR通常不应用于PGS，但 目前也有应用荧光PCR进行染色体整倍体检测的少量报道［8］。 另一早期广泛应用于PGD的标准技术是荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)，1994年该技术被首次应用于胚胎性别诊断［9］。FISH采 用荧光标记的特异性探针与处于分裂间期的胚胎卵裂球染色体DNA杂交，通过观 察荧光信号的数量和分布，鉴定胚胎性别或判断染色体是否平衡［10］。但由于卵裂 球的固定效果不稳定，探针也存在非特异性结合的情况，因此容易出现不可靠的结 果［11］。传统的FISH无法一次性检测所有染色体，一般每个卵裂球细胞只能标记 5条染色体，一次实验耗时5 h左右，因此很少用于PGS，直至近年才有采用 FISH进行染色体整倍性的检测报道［12］。 比较基因组杂交技术(comparative genomic hybridization，CGH)利用不同颜色 的荧光标记待测样本和对照组的基因组，然后与正处于人类中期染色体杂交，最后 通过两组荧光强度的差异，判断染色体的重复和缺失，其分辨率比FISH高5~10 M［13-14］。由于传统的CGH需要制备人类中期染色体，操作较为繁琐