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三、冰冻保护剂的应用 　　冰冻保护剂（Cryoprotective agent，CPA）也称抗冻剂，为植物低温保存必不可少。 特点：易溶于水，对细胞无毒害，容易从组织或细胞中清除。 作用：增加膜透性，加速细胞内水流到细胞外结冰；稳定细胞膜结构，阻止低温伤害；降低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶的生长。 依据渗透性的有无，可将CPA分为两类： 渗透型 非渗透型 本文档共47页；当前第31页；编辑于星期日\21点25分 渗透型冰冻保护剂 特点：多为中性低分子物质，在溶液中易与水分子结合发生水合作用，增加溶液的粘稠度，降低溶液的冰点，从而弱化了水结晶的过程，达到保护材料的目的。 种类：常用的有甘油、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）。 不同渗透型冰冻保护剂渗入细胞的能力及其对水分子活性的影响也有不同，如甘油适用于慢速冷却，DMSO容易渗入细胞，但有轻微毒性。 本文档共47页；当前第32页；编辑于星期日\21点25分 非渗透型冰冻保护剂 特点：能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，在特定温度下能够降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护作用。 种类：主要有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖(Dextrane)、聚乙二醇(PEG)、白蛋白(Albumin)、羟乙基淀粉(HES)等。 本文档共47页；当前第33页；编辑于星期日\21点25分 四、解冻方法 　　根据解冻速度分为快速解冻和慢速解冻两种方式： 快速解冻：能使材料迅速通过冰融点的危险温度区(-50～-10 ℃)，防止降温过程中形成晶核对细胞造成损伤。通常的做法是把样品放入37～45℃温水浴中，待冰完全溶化后（约90s）立即移开。 慢速解冻：对于脱水处理后干冻保存的材料，一般认为应先置于0℃下一段时间，再于室温下缓慢解冻效果较好。 本文档共47页；当前第34页；编辑于星期日\21点25分 种质离体保存详解演示文稿 本文档共47页；当前第1页；编辑于星期日\21点25分 优选种质离体保存 本文档共47页；当前第2页；编辑于星期日\21点25分 种质资源保存方法 就地保存（自然保护区） 迁地保存（种质圃保存） 种子保存 离体培养保存 基因文库保存 常温限制生长保存 中低温调控生长保存 低温干燥保存 减压保存 低温保存（低于-80 ℃） 超低温保存（-196 ℃） 难以长期保持种质寿命，对种质保存的作用不是很大。 按保存条件 （温度、含氧量等） 按材料和方式 本文档共47页；当前第3页；编辑于星期日\21点25分 第一节 概 述 一、植物种质资源低温保存的意义 防止物种或品种灭绝 节省人力物力 便于种质资源的国内外交流 本文档共47页；当前第4页；编辑于星期日\21点25分 二、超低温保存的概念 低温保存（cryopreservation）是由cryo和preservation组成，在 英语中cryo为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。从词义 看，低温所涉及的温度范围是不确定的。 超低温:≤-80℃ 极低温:≤-70℃ (干冰温度) 低温:≤4℃ 本文档共47页；当前第5页；编辑于星期日\21点25分 但对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。如 果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭 受冻害而死亡。如甜橙树发生冻害的临界温度通常在-6.5℃，枳壳 通常在-20℃左右（沈德绪等，1986）。 本文档共47页；当前第6页；编辑于星期日\21点25分 低温保存（Cryopreservation），是指将植物的组织或细胞经过防冻处理后，在低于-80℃条件下保存的方法。 超低温保存：将植物的组织或细胞经过防冻处理后，在-196℃的极端低温下保存的方法。 本文档共47页；当前第7页；编辑于星期日\21点25分 超低温保存的优点: 在超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，呈现“假死”状态。因此，细胞、组织和器官在此过程中不会发生遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能。 在超低温条件下，生命的代谢和衰老过程也基本停止，故能够实现长时期的保存。 本文档共47页；当前第8页；编辑于星期日\21点25分 超低温保存的意义: 可以在有限空间内保存大量种质材料； 与种子保存相比，可以不受时间和种子含水量的制约； 与试管苗相比，可以避免频繁继代培养造成的变异，并大幅度减少工作量。 本文档共47页；当前第9页；编辑于星期日\21点25分 常用的超低温保存方法： 冷冻诱导保护性脱水的超低温保存法 玻璃化处理的超低温保存法 本文档共47页；当前第10页；编辑于星期日