实验考马斯亮蓝法测定蛋白质含量.docxVIP

实验五 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 一、实验目的 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法 熟练分光光度计的使用和操作方法。 二、实验原理 考马斯亮蓝 G250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在 465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为 595nm。考马斯亮蓝 G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm 下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。 考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。 离心机的使用说明： 1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。 2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。 3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。 分光光度计的使用说明： 1.接通电源开关，预热 20min 后，再选择须用的单色光波长。 2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手， 使对照比色皿（溶液装入 4／5 高度，置第一格）置于光路上，调节 100％透射比按钮，使吸光度值 A=0.00。 3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上， 读出吸光度值。 4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。 5. 电源开关置于“关”，拔下电源插头。 三、试剂与器材： 试剂： （1）0.9％NaCl：9g NaCl 溶解在 1L 的容量瓶中。 （2）标准蛋白质：称取 50mg 结晶牛血清蛋白定溶于 50ml 容量瓶里。 （3）染液：考马斯亮蓝 G-250 0.5g，溶于 250mL95%乙醇，再加入 500mL85％ (W／V)磷酸，保存于棕色瓶中，称为母液。取 150 mL 然后加蒸馏水定容到 1000mL，保存于棕色瓶中，备用。 器材： 试管；吸管 10mL、l5mL、lmL、0.1mL；722 分光光度计 四、操作方法 标准曲线的制备 取 6 支试管，按下表加入各试剂： 管号 0 1 2 3 4 5 标准蛋 白溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 (ml) 0.9%NaC l 溶液 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 (ml) 待测样 品(ml) ／ ／ ／ ／ ／ ／ 考马斯 亮蓝试 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 剂(ml) 摇匀，放置 5min，测吸光度值A595nm以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、 摇匀，放置 5min，测吸光度值 A595nm 线。 待测样品测定 试管中加蛋白质样品 1.0mL ，再加入 5.0mL 考马斯亮蓝 G-250 试剂，摇匀， 放置 5min 后，在 595nm 波长下吸光度值，记录 A595。根据所测 A595 从标准曲线上查得蛋白质含量。并计算蛋白样品的浓度（mg/ml）。 五、实验结果及分析 六、思考题 蛋白质含量的测定还有哪些方法？其优缺点是什么？