HY/T 151-2013海洋微藻中溶血毒素的检测　血细胞法.pdf

; ICS07.060 13.060 Z17 中 华 人 民 共 和 国 海 洋 行 业 标 准 / — HY T151 2013 海洋微藻中溶血毒素的检测 血细胞法 — Detection of hemolytic toxins in marine microalgae Erythrocyte lysis assay 2013-04-25发布 2013-0 5-01实施 国 家 海 洋 局 发 布 / — HY T151 2013 前 言 本标准按照 / — GB T1.1 2009 给出的规则起草。 本标准由国家海洋局南海环境监测中心提出。 本标准由全国海洋标准化技术委员会( / )归口。 SAC TC283 本标准起草单位:国家海洋局南海环境监测中心、暨南大学。 本标准主要起草人:李秀芹、杨维东、黄楚光、徐志斌、高阳、彭颖慧、上官茂森、林端、方宏达、吴进孝、 董燕红、陈嘉辉、吴玲玲、曲念东、刘洁生。 Ⅰ / — HY T151 2013 海洋微藻中溶血毒素的检测 血细胞法 范围 1 本标准规定了用血细胞法检测海洋微藻中溶血毒素活性的方法及技术要求。 本标准适用于自然海水中海洋微藻细胞中溶血毒素的检测,也适用于实验室培养的海洋微藻细胞 中溶血毒素的检测。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 — 海洋监测规范 第3部分:样品采集、贮存与运输 GB 17378 .3 2007 / — HY T069 2005 赤潮监测技术规程 术语和定义 3 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 3.2 海洋微藻 海水中粒径大于 m arine microalgae 的浮游植物。 2 m μ 溶血毒素 he m olytic toxins 一类主要由微藻产生能够导致机体红细胞及其他真核细胞裂解的糖脂类物质,其主要作用于敏感 细胞的细胞膜脂质部分。 3.3 溶血活性 he m olytic activity 溶血毒素溶解血细胞的效力。 3.4 溶血单位 he m olytic units 用来表述溶血 毒 素 活 性 的 量 纲。1个 溶 血 单 位 相 当 于 在 1mL反 应 系 统 中 (含 柠 檬 酸 缓 冲 液 的兔血红细胞0.80 mL和溶血毒素粗提液 ),在 水浴 使红细胞溶 、 0.15 mL 0.5% 0.05 mL 37℃ 30 min 洋地黄皂苷。 解50%时所需溶血毒素的量,相当于( ) 1.30±0.39 g μ 3.5 血细胞法 erythrocyte lysis assay 针对溶血毒素破坏、溶解血细胞的特性建立的一种检测方法,该方法以溶血单位为量纲来定量溶血 毒素的溶血活性。 3.6 赤潮水样 red tide water 微藻细胞浓度达到或超过 / — 规定的基准浓度的海水样品。 HY T069 2005 1 / — HY T151 2013 3.7 非赤潮水样 non-red tide water 微藻细胞浓度未达到 / — 规定的基准浓度的海水样品。 HY T069 2005 原理 4 利用氯仿、甲醇和水体积比为13∶7∶5的提取液萃取微藻细胞中的溶血毒素,经减压蒸馏浓缩后, 再以甲醇溶液溶解残留物,得溶血毒素粗提物;用粗提物溶解血细胞,同时配置洋地黄皂苷标准系列溶 液绘制工作曲线,结合粗提物的溶血情况计算溶血毒素的活性。 试剂和材料 5 除非另作说明,本标准所用试剂均为分析纯,水是蒸馏水或者等效纯水。 氯仿( CHCl )。 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 3 甲醇( )。 CHO 4 柠檬酸( )。 · CHO HO 6 8 7 2 洋地黄皂苷( )。 , CH O 99% 56 92 29 氯化钠(N aCl)。 柠檬酸钠( · )。 CHNaO 2HO 6 5 3 7 2 葡萄糖( )。 CH O 6 6 12 曲拉通 ( )。 X-100C H O 34 62 11 医用肝素钠注射液[( CH NS Na 3 20 ), ]。 / 5000IU mL 12 16 2 提取液:氯仿、甲醇和水体积比为13∶7∶5。 柠檬酸溶液( / ):称取柠檬酸( · ) ,置于200 mL烧杯中,用水溶解后 2 molL CHO H O 42.0g 6 8 7 2 移入100 mL容量瓶中,稀释至刻度,摇匀备用。 洋地黄皂苷母液( ):称取洋地黄皂苷1.0 mg,置于200 mL烧杯中加水搅拌至溶解(必 / 10 gmL μ 5.12 要时可水浴加热),移入100 mL容量瓶中,稀释至刻度,摇匀,备用。 ),