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中国明对虾精子发生过程中h4蛋白的变化 手足动物精子的结构独特，不同于一般动物的精子。虽然其形态结构因科而异，但在无鞭毛、运动、非浓缩核和壳中没有碱性蛋白的情况下，外壳中的碱性蛋白是生存的重要原因之一。国内外科学家对甲壳动物精细核的碱性蛋白研究较少，发现不同类型的核电厂碱性蛋白分布不同。许多科学家关注这些精细核的碱质损失。 中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)是重要的经济虾类,属于游泳亚目,有关其精子核碱性蛋白的研究未见报道.本文以真核生物细胞中最保守的核碱性蛋白H4在不同物种间的保守性为理论依据,利用免疫电镜定位技术,确定中国明对虾精子发生过程中细胞核碱性蛋白H4的定位,阐明其核碱性蛋白H4的变化规律,为进一步研究非浓缩核精子DNA的保护机制以及受精过程中雄性原核的构建提供基础资料. 1 材料和方法 1.1 虾幼场育苗场 中国明对虾于2006年8—9月从河北省唐海县唐海对虾育苗场购买;一抗为兔抗H4 IgG,邮购于法国Calbiochem公司;二抗为10 nm金标羊抗兔H4 IgG,邮购于北京博奥森生物技术有限公司. 1.2 酒精与丙酮脱水 胶体金电镜免疫定位采用包埋后染色方法.对中国明对虾雄性个体的精巢与储精囊材料先用戊二醛与多聚甲醛混合液固定,漂洗后经甘氨酸孵育,再漂洗,不经锇酸固定而进行酒精与丙酮脱水,环氧树脂812包埋,加热聚合,超薄切片捞在金载网上;金载网材料经饱和过碘酸钠蚀刻后,用Tris-HCl 水溶液加热,冷却后用羊血清(体积比1∶50稀释)进行封闭(此步及以后免疫相关操作在湿盒中进行),然后进行一抗(按体积比1∶20稀释)孵育,4 ℃过夜,漂洗后再用羊血清(体积比1∶50稀释)封闭,经二抗(按体积比1∶5稀释)孵育,漂洗,干燥后进行醋酸铀染色,用JEM-100SX透射电镜(75 kV)观察拍照.阴性对照用PBS代替一抗,其余步骤相同. 2 结果 2.1 实验型精母细胞 在用透射电镜对材料进行观察过程中,我们发现精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞的细胞核当中存在有金颗粒,并且主要处于深染的异染色质区;细胞质中仅有少量的金颗粒,而且处于富集核糖体的非囊泡区(图1 A-D). 2.2 内质网囊泡多且金颗粒的形成过程 新生成的精细胞细胞核呈椭圆形,染色质颗粒状,细胞质中内质网囊泡多.此时的细胞核与细胞质都结合有大量的金颗粒,在细胞质内质网囊泡的边缘或非囊泡区结合金颗粒较多(图1 E). 2.3 精细胞变性期内压金颗粒的形成 精细胞变态前期的早些时候,核染色质逐步凝聚,细胞质中部分内质网囊泡融合形成环核内质网,同时,伴随细胞核极化,部分内质网囊泡与线粒体囊泡在细胞核相对的一侧融合形成前顶体囊,在前顶体囊远离细胞核的一端出现顶体原基.此阶段在前顶体囊中有金颗粒,在细胞核中也存在金颗粒,而在围核细胞质中没有金颗粒的结合(图1 F). 精细胞变态前期的晚期阶段,伴随细胞核染色质的进一步凝聚,细胞核缩小,环核内质网变得比较松散,部分区域片段化,前顶体囊扩大,顶体原基也随之变大.此阶段在细胞核的异染色质区域有金颗粒的结合,围核细胞质带中有少量金颗粒,前顶体囊与顶体原基中金颗粒比先前阶段增加(图1 G,H). 2.4 金颗粒的形成 精细胞变态中期,相邻细胞之间逐渐分开,细胞核凝聚的染色质逐渐解聚为颗粒状,核膜及细胞质带中的环核内质网逐步溶解,顶体囊浓缩变小,顶体原基变大并与前顶体膜相连结(图1 I,J).该时期细胞核区有大量金颗粒,并且在近顶体区域结合多,远离顶体区域少,与细胞核相邻近的顶体区域金颗粒多,顶体原基中面向细胞核的区域金颗粒多,由细胞核到顶体区再到顶体原基,金颗粒呈现一种从细胞核涌入顶体囊,再汇聚到顶体原基的趋势;围核细胞质带中结合有金颗粒,可见顶体下细胞核两侧的个别金颗粒已通过膜复合体分泌进入顶体囊区域,而与顶体囊相对的细胞核底部细胞质带中的金颗粒,可通过小囊泡排出细胞;相邻细胞分开时会有细胞质散失在环境中,其上也有金颗粒结合,从图3 I可以看到环境中的金颗粒可能结合到将来生成成熟精子顶体囊外膜的部位. A. 精原细胞中H4蛋白(箭头)分布,×5 000.B. 初级精母细胞中H4蛋白(箭头)分布,×6 000.C. 图版B的局部放大,细胞核与细胞质中都存在碱性蛋白H4,并且细胞质中H4处于核糖体富集区域,而细胞核中H4处于电子密度高的异染色质区,×25 000.D. 次级精母细胞中H4蛋白分布,细胞核多于细胞质,并且细胞核中H4蛋白处于异染色质区,×10 000.E. 新形成精子细胞中H4蛋白分布,细胞核中H4蛋白分布均匀,细胞质中H4蛋白分布在非囊泡区,×8 000.F. 变态前期的早期精细胞,细胞核与前顶体囊中存在H4蛋白,而在围核细胞质中没有H4蛋白,×10 000.G. 变态前