TroponinⅠ及变体NGR-TroponinⅠ可容性表达和纯化的研究的中期报告.docxVIP

TroponinⅠ及变体NGR-TroponinⅠ可容性表达和纯化的研究的中期报告 本研究旨在探索TroponinⅠ及变体NGR-TroponinⅠ的可容性表达和纯化方法，并对表达的蛋白进行初步的生物学性质分析。截至目前，已经完成了一部分的实验。 1.原核表达系统的构建 在本研究中，E.coli BL21(DE3)菌株被选择作为目标表达菌株。首先，筛选合适的载体，包括pET28a(+), pET32a(+), pET41a(+), pGEX-6p-1等。以pET28a(+)作为基础载体，构建了pET28a-TnI和pET28a-NGRTnI表达载体。经PCR验证，载体中TnI和NGRTnI的编码序列均正确插入。 2.表达蛋白的优化和纯化 经优化，采用2 mM IPTG处理BL21(DE3)/pET28a-NGRTnI表达菌株，在37°C下进行诱导24小时，得到2000-3000 μg/L的可溶性NGRTnI蛋白。然而，TnI的表达量较低，仅在SDS胶片上留下微弱的带状。经Brilliant Blue染色，TnI蛋白在胶条上难以检测。未能得到纯化的TnI蛋白。 对NGRTnI蛋白进行了初步的纯化。采用亲和纯化柱（HisTrap HP）和离子交换柱（HiTrap Q HP）对蛋白进行两步纯化。经SDS分析，得到了达到90%纯度的NGRTnI蛋白。 3.初步的生物学性质分析 通过Western blot检测NGRTnI蛋白的免疫反应性，结果显示该蛋白能够与TroponinⅠ的抗体反应。采用质谱技术对NGRTnI蛋白进行了序列鉴定，鉴定出的氨基酸序列与理论值一致。 综上，本研究初步探索了TroponinⅠ及变体NGR-TroponinⅠ的可容性表达和纯化方法，获得了高纯度的NGRTnI蛋白。对表达的蛋白进行了初步的生物学性质分析。未来将会继续优化TnI的表达条件，并对表达蛋白进行更深入的生物学性质研究。