马兰草总生物碱的提取工艺优化及其对羟基自由基清除作用.docxVIP

马兰草总生物碱的提取工艺优化及其对羟基自由基清除作用 马兰草是科木兰的一种完整植物，也被称为紫菊、竹节草、鱼条溪、灯火草。大多生长于路边、田野、山坡,全国大部均有分布,资源丰富。多用于编制草席、汽车靠垫、拖鞋等。在《嘉祐本草》中记载,马兰草味辛平无毒,有凉血、清热、利湿、解毒的功效［１］。近年来,已有多家贵州民族药业以马兰草药材为原料药投料,其药材使用量迅猛增加［２］。马兰草的药用功效与其所含的黄酮、多酚、生物碱和鞣质等成分有关。天然药物低毒、无害、无副作用,从天然植物中寻找抗菌、抗癌的药用成分,替代化学合成且副作用较大的抗生素,是目前医学领域的重要研究课题。生物碱一般是指存在于植物中天然的碱性含氮化合物,对人和动物有强烈生理作用的极有价值的药物［３］。目前,未见马兰草生物碱提取及其测定的相关报道。笔者采用乙醇浸提法系统研究了马兰草总生物碱的提取,并测定了提取液对羟基自由基的清除效果,以期为马兰草作为新的药用植物资源开发利用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 化工试剂及仪器 1.1.1马兰草马兰草购于安徽海鑫中药饮片有限公司。 1.1.2试剂盐酸水苏碱标准品(南京替斯艾么中药研究所),雷氏盐、碘化铋钾(天津市光复精细化工研究所),30%双氧水、无水乙醇(上海联试化工试剂有限公司),七水合硫酸亚铁(汕头市西陇化工有限公司),水杨酸(天津市化工研究所)。 1.1.3仪器九阳料理机(九阳股份集团),循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司),电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司),可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)。 1.2 总原则和正交试验设计 1.2.1盐酸水苏碱标准工作曲线的绘制分别移取0.2 mg/mL的盐酸水苏碱0、1.00 mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL和8.00mL于25mL容量瓶中,各加入新鲜配制的2%雷氏盐3.00mL,用0.1mol/L的盐酸定容,取清液在520nm处测定吸光度。用△A对水苏碱浓度C作图,绘制标准曲线(图1),得回归方程为 △A=0.470 3 C+0.004 8(△A=A０-A,A０为空白溶液的吸光度,A为对照品的吸光度)［４］。 1.2.2生物碱含量的测定由于雷氏盐在酸性介质中可与生物碱生成难溶于水的有色络合物,用雷氏盐比色法,以盐酸水苏碱为标准品,用分光光度法测定总生物碱的含量［５］。 称取马兰草粉末1.000g,用乙醇浸提,抽滤,将滤液用0.1mol/L的盐酸定容于50mL容量瓶中。取出10mL上述溶液于25mL容量瓶中,加入新鲜配制的2%雷氏盐3.00mL,用0.1 mol/L的盐酸定容,取清液在520nm处测定吸光度。 1.2.3单因素考察试验 1)乙醇浓度。在提取温度60℃,料液比1∶15,提取时间为90min的条件下,考察乙醇浓度分别为20%、30%、40%、50%和60%的提取率。 2)料液比。在乙醇浓度为40%,提取温度为60℃,提取时间为90min,料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的条件下提取,考察料液比对提取率的影响。 3)提取时间。分别在乙醇浓度为40%,提取温度为60℃,料液比为1∶20条件下,考察时间分别为30min、45min、60min、75min和90min对提取率的影响。 4)提取温度。在乙醇浓度为40%,料液比为1∶20,提取时间为60 min的条件下,考察温度分别为40℃、50℃、60℃、70℃和80℃时对提取率的影响。 1.2.4正交试验设计根据相关文献［６－７］和单因素试验考察结果,选取乙醇浓度(A)、提取时间(B)、浸提温度(C)及料液比(D)为考察因素,每个因素3水平,选取L９(3４)正交表进行试验,其因素水平见表1。 1.2.5提取物对·OH的清除效果参照Fenton方法建立反应体系模型。依次移取8.8mmol/L的双氧水1mL和9mmol/L的硫酸亚铁1mL,混合均匀后加入1mL 9mmol/L的水杨酸乙醇溶液,用蒸馏水定容至10 mL。 在37℃ 的恒温水中反应15min,冷却后在510nm的波长下测其A值,以蒸馏水为参比液,该值即可作为AO值［８－９］。量取马兰草的提取液2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL和6.00mL加入测定体系测其A值,该值即为AX值。 对羟基自由基的清除率= [(AO -AX)/AO]×100%(式中,AO为试剂空白液的吸光度;AX为加提取液时的吸光度)。 2 结果与分析 2.1 不同用量提取 2.1.1提取浓度由图2A可知,随着乙醇浓度的加大生物碱提取含量增大,当乙醇浓度为40%时提取效果最佳。继续加大浓度,生物碱提取含量下降,这是因为浓度过大其他脂溶性物质溶出的增大,会干扰生物碱的提取［１０］。 故较适宜的浓度为30%~50%。 2.1.2料液比