烟草转化及CoIP方法.docx

CoIP protocol From Guo Siyi 烟草转化体系 将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在 YEB 液体培养基中培养过夜，到 OD600 约 1.5 左右（大约 20h），同时摇菌 P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES， 100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定 OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入 P19，最终使得每种菌液成分的 OD600 在 0.8 左右；然后将混合的菌液在 28 ℃下以 200 rpm 的转速再培养至少 3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及 对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养 2 d，然后再转入光下培养 2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察 GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。 免疫共沉淀（CoIP） 将 VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如 FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。至少设定两组样品：即 FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及 FLAG-VER2/GFP。检测目的蛋白是否表达：用 Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用 SDS分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做 Western Blot 用 （WB）标签抗体 FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。并根据 WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。 Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行） 取两份 30 μL protein A/G beads 到 EP 管中放于冰上，用 600 μL 的蛋白提取 buffer 重悬 beads，4 ℃离心 1000 g 1 min。冰上静止 1 min，弃上清。（重复此操作 3 次） 将适量蛋白溶液（根据 WB 结果，调整实验组和对照组蛋白样品，使得目的蛋白的表达基本相当，总蛋白在 400-600 μg，溶液总体积在 1 mL 左右，可用蛋白提取 buffer 补齐） 加入 beads 中，4 ℃颠倒混匀 1-2 h；然后 4 ℃离心 2000g 1 min，将上清转移至新 EP 管中，取 20 μL 样品待用，即 Input。 免疫沉淀： 将上清中加入适量的 GFP 抗体，根据 WB 结果来加，10-20 倍于 WB 的抗体用量。4 ℃ 颠倒混匀 1-2 h，快到时间时，重新准备两份 30 μL protein A/G beads 在新 EP 管中放于冰上待用（用蛋白提取 buffer 重悬 3 次）。将混匀的蛋白+抗体溶液加入含有 beads 的 EP 管中，4 ℃颠倒混匀 1-2 h。 清洗杂蛋白： 4 ℃离心 1000 g 1 min ，将上清转移到新 EP，此为 UBP（unbinding protein），存于冰上待用。将 beads 用 wash buffer 清洗 4-5 次，600 μL/次，每次重悬后 4 ℃离心 1000 g 1 min。留 40 μL 最后一次的 wash buffer（即 W5）于冰上待用。 洗脱结合蛋白： 将 beads 用 50 μL elution buffer 洗脱后加 10 μL 6× SDS loading buffer，或者用 60 μL 1×SDS loading buffer 煮沸 5 min。WB 检测 FLAG-VER2 蛋白是否与 TaGRP2-GFP 蛋白共沉 淀 将洗脱后的样品 Elution 及 UBP，W5 及 Input（实验组 +对照组共 8 个样品）跑SDS电泳并用 FLAG 抗体做 Western Blot 检测实验组中是否有 FLAG-VER2 的信号带，如有则 VER2/TaGRP2 互作，同时对照组中不能有 FLAG-VER2 的信号带，并且 W5 中不能有信号带。同时用 GFP 抗体确保 TaGRP2-GFP/GFP 分别在两组 elution 中都能有信号即保证用 GFP 抗体做的免疫沉淀成功。