《番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术规程》.docxVIP

Q/LB.□XXXXX-XXXX PAGE 2 ICS FORMTEXT 65.020 CCS FORMTEXT GXAS FORMTEXT B 04 团体标准 T/ FORMTEXT GXAS FORMTEXT XXXX— FORMTEXT XXXX FORMTEXT ????? FORMTEXT 番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术规程 FORMTEXT Technical code of practice for evaluation of tomato for resistance to bacterial spot FORMDROPDOWN FORMTEXT ????? FORMTEXT XXXX- FORMTEXT XX- FORMTEXT XX发布 FORMTEXT XXXX- FORMTEXT XX- FORMTEXT XX实施 FORMTEXT 广西标准化协会??发布 STYLEREF 标准文件_文件编号 T/GXAS XXXX—XXXX PAGE 3 STYLEREF 标准文件_文件编号 T/GXAS XXXX—XXXX PAGE 4 番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术规程 范围 本文件规定了番茄细菌性斑点病抗性的相关术语和定义、接种体制备、病原菌鉴定、鉴定条件和试验设计、接种、病情调查、抗病性评价的操作指示。 本文件适用于番茄细菌性斑点病抗病性苗期室内鉴定和评价。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 1858.1 番茄主要病害抗病性鉴定技术规程 第1部分：番茄抗晚疫病鉴定技术规程 术语和定义 NY/T 1858.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 番茄细菌性斑点病 由丁香假单胞杆菌番琉致病变种（Pseudomonas syringae pv.tomato）引起。叶片是主要的受危害部位，叶片边缘发病明显。初期斑点细小，呈圆形或近圆形，中间深褐色，周围有黄色晕圈，随后病斑慢慢扩大、增多，发病中后期，病斑变成黑色、深褐色，病斑直径2 mm～4 mm，多个病斑可相互连接形成不规则的较大病斑。 试剂与材料 试剂 所用试剂在未加说明时均采用分析纯试剂。实验室用水应符合GB/T 6682中规定的三级水要求。 NA液体培养基 称取牛肉浸膏3 g，蛋白胨8 g，蔗糖或葡萄糖10 g，酵母浸膏1 g，加蒸储水至1 000 mL，加热煮沸，调节pH至7.0，分装，高压灭菌(121 ℃，25 min)。 NA固体培养基 称取牛肉浸膏3 g，蛋白胨8 g，蔗糖或葡萄糖10 g，酵母浸膏1 g，加蒸储水至1 000 mL，先将琼脂加热熔化于大部水中，再将其余各成分用少量水化开加入，煮沸，调节pH至7.0，分装，高压灭菌(121 ℃，25 min)。 接种体制备 病原菌分离 采样时选取发病典型、新发病的番茄叶片，用封口袋保存，做好采集地点、时间的记录，及时带回实验室，用常规组织分离法分离病原菌。 将工具放置在超净工作台上，打开紫外灯灭菌40 min。用剪刀剪取病健交界处组织并制片，在显微镜下进行观察是否具有喷菌现象。将出现喷菌现象的组织在无菌条件下进行分离。用75％的乙醇溶液消毒30 s后用无菌水冲洗1次，再用0.1％HgCl消毒20 s后用无菌水冲洗3次。将清洗后的组织剪碎，加入3 ml无菌水，静置10 min。接种环在酒精灯上烧红后晾冷，沾取菌液，在NA固体培养基上划线。于28 ℃恒温培养箱下培养。 病原菌纯化 分离培养2 d后，用消毒接种环挑选单菌落在NA固体培养基上进行划线。重复进行纯化操作，直至菌落形态一致，无杂菌。 接种体保存 将纯化菌落移至1 ml灭菌离心管中，放置在-25 ℃冰箱中保存。 病原菌鉴定 致病性鉴定 接种悬浮液制备 将保存的病原菌转移到NA液体培养基中，温度28 ℃，转速120 r/min，震荡培养48 h。在波长λ＝600的条件下测定OD值，将菌液稀释至OD值0.6～0.8，菌液浓度为1×108 cfu/ml。 烟草过敏反应 用注射器吸取菌液，沿着叶脉注射到烟草叶片叶肉组织中，24 h后观察是否出现斑枯过敏反应。 接种 用注射器吸取菌液，沿着叶脉注射到健康番茄植株叶片组织中，接种后，置于温度25 ℃，空气湿度90％～100％的人工气候箱中培养。 结果判定 烟草发生斑枯过敏反应和接种健康番茄植株后，叶片出现斑点，斑点有黄色晕圈等典型症状可初步判定病原菌为番茄细菌性斑点病致病菌。 病原菌16s rDNA分子鉴定 DNA制备 保