化妆品舒缓功效测试方法——基于 PolyI：C和LPS诱导角质形成细胞的炎症因子（IL-8）体外检测方法.pdfVIP

化妆品舒缓功效测试方法—— 基于PolyI:C+LPS诱导角质形成细胞的炎症因子(IL-8) 体外测试方法 1 范围 本文件规定了一种化妆品舒缓功效的体外测试方法。 本文件适用于采用人源角质细胞炎症因子IL-8检测的试验评价化妆品及原料的舒缓功效。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语及定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 角质形成细胞 keratinocyte 存在于皮肤、毛发、指甲等中的一种可合成角蛋白的细胞。 3.2 炎症因子 IL-8 IL-8属于白介素家族的一种促炎因子，是湿疹发生过程中角质形成细胞释放的特异性促炎因子， 角质形成细胞释放IL-8后进一步会激活T细胞介导的特异性免疫反应，从而诱导红斑瘙痒等不适症状 的出现。 3.3 酶联免疫吸附测定 enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA 一种将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的高灵敏度分析技术。 原理是用酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记抗体，该酶标抗体可与待测的抗原或抗体免疫 吸附结合，酶所催化的呈色反应可以间接反映抗原的量。 4 试验原理 本方法采用PolyI:C和LPS联合诱导体外角质形成细胞，使其释放湿疹（一种典型的炎性皮肤病） 特异性的炎症因子IL-8 ，IL-8释放后会进一步激活特异性免疫反应，进而介导炎症的级联放大，最终 出现红斑瘙痒等不适症状，而抑制IL-8释放的化妆品可以达到舒缓瘙痒红斑等不适症状的作用。通过 采用IL-8酶标抗体的酶标板进行测定，通过测定酶标仪450nm波长下测定吸光度（OD值）得到IL-8含 量，受试物组与阴性对照组比较来计算IL-8抑制率。通过测试受试物对IL-8抑制率情况，来评价样品 的舒缓功效。 5 试剂和材料 5.1 DMEM培养液：低糖，葡萄糖含量 1g/L 。 5.2 胰蛋白酶-EDTA溶液：胰蛋白酶浓度0.25% 。 5.3 新生牛血清（NBS ）。 5.4 细胞培养液：含10%新生牛血清（5.3 ）的DMEM培养液（5.1 ）。 5.5 磷酸盐缓冲液（PBS ）：pH 7.2~ pH 7.4 。 5.6 IL-8 ELISA检测试剂盒。 5.7 细胞：原代人源角质形成细胞（10代以内）或人永生化表皮角质形成细胞HaCaT 。如果培养条件 能满足细胞的特殊需要，其他表皮细胞或表皮细胞系也可用于本试验，但必须证明其等同性。 6 仪器 6.1 分析天平：分度值为0.0001 g 。 6.2 二氧化碳培养箱。 6.3 可调节移液器：1000 μL、200 μL、300 μL多道移液器。 6.4 超净工作台。 6.5 离心机。 6.6 倒置显微镜。 6.7 细胞板振荡器。 6.8 酶标仪。 6.9 CO2 培养箱。 6.8 恒温培养箱。 6.9 倒置显微镜。 7 试验步骤 7.1 实验前准备 7.1.1 受试物准备 水溶受试物直接采用培养液作为溶剂。水难溶的受试物使用二甲基亚砜（DMSO ）作为溶剂。其 余溶剂需在使用溶剂前。必须仔细评估受试物的特殊性质，是否与受试物发生反应。 使用涡旋混合/或超声处理和/或加热到适当温度等方法辅助溶解，除非这些操作会影响到受试物 的稳定性。 除有稳定性数据证明储备液可接受，受试物均使用前新鲜配置直接使用。 受试物毒性有毒，则根据毒性预试验选择的无毒剂量（即活性大于90% ）浓度进行表面给药。 7.1.2 刺激物准备 采用PolyI:C和LPS联合刺激，其中PolyI:C 的推荐使用浓度为60μg/mL ，LPS 的推荐使用浓度为 100μg/mL，二者混合后添加到模型培养液中配置成诱导工作液，具体诱导剂量可根据试验室培养细胞 特性进行调整。 试验可接受标准为：与阴性对照组相比，刺激物作用下阴性对照组的IL-8含量显著性增加（具有 统计学差异 P0.05 ）。 7.1.3 阳性对照 每一次试验都应同时使用阳性对照进行试验。例如地塞米松，给药浓度为100 μg/mL 。具体给药 浓度也可根据各试验室培养细胞特性进行调整。试验可接受标准为：与阴性对照组相比，阳性对照组 IL-8 的分泌量显著性降低（具有统计学差异 P0.05 ）。 7.2 预试验（细胞毒性试验） 7.2.1 细