DB12∕T 1007-2020 茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测技术规程.docxVIP

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2023-11-21 发布于河北
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ICS?65.020.01 B?16 DB12 天津市地方标准 DB12/T?1007—2020 茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测技术规程 Technical?regulation?of?detection?for?toato?yello?leaf?curl?virus?carried?by?seeds and?seedlings?of?solanu?fruit?vegetables 2020?-?12?-?17?发布 2021?-?01?-?16?实施天津市市场监督管理委员会发?布 DB12/T?1007—2020 前言本标准按照GB/T?1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市植物保护研究所。本标准主要起草人：王勇、高苇、张春祥、杨利娟、刘晓琳、霍建飞、姚玉荣。 I .提供下载DB12/T?1007—2020 . 提供下载茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测技术规程 1 范围本标准规定了茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测的仪器和试剂、检测程序、结果判定、样品和菌株保存。本标准适用于农业生产中，茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒的检测。 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订版）适用于本文件。 GB/T?6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 3.1 番茄黄化曲叶病毒 toato?yeLLo?leaf?curl?virus（TYLCV）番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属病毒，因该属病毒在自然条件下只能由烟粉虱以持久方式传播，又被称为粉虱传双生病毒，是一类具有孪生颗粒形态的植物DNA病毒，广泛分布于热带和亚热带地区，在烟草、番茄、南瓜、木薯、棉花等重要经济作物上造成毁灭性危害。番茄黄化曲叶病毒病基本信息参见附录A。 3.2 种苗传播病害 seedling-borne?disease 种苗携带病原菌进行传播的一类植物病害。 4 仪器和试剂 4.1 仪器高速离心机、灭菌锅、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、旋涡振荡器、分析天平（感量1/10000g）。 4.2 试剂 4.2.1 总体要求除另有规定外，所有试剂均为分析纯试剂，实验用水符合GB/T?6682。 4.2.2 PBS?缓冲液 NaCL?8.10?g、NaH2PO4?0.18?g、Na2HPO4?1.97?g、蒸馏水1000?L，pH?7.4。 1 .提供下载DB12/T?1007—2020 . 提供下载 4.2.3 商用植物?DNA?提取试剂盒或?DNA?提取试剂 DNA提取试剂主要有Lysis缓冲液和乙酸钾缓冲液。 4.2.4 裂解缓冲液 100?Tris-HCL?pH?8.0；50?EDTA，pH8.0；1%SDS；10μg/L?RNase?A。 4.2.5 乙酸钾缓冲液乙酸钾缓冲液3.0，pH5.5。 4.2.6 凝胶电泳试剂琼脂糖，TAE?Buffer，核酸染料GoLdenvie。 4.2.7 PCR?试剂 aster?ix。 5??测试程序 5.1 检测样品应以种子来源、育苗时间和育苗地点等相同的同一品种的种苗为一个种苗批次，每个种苗批不得大于1万株，如果该批种苗标记或能明显地看出该批种苗在形态或文件记录上有异质性的证据时，应拒绝取样。对一批种苗进行抽取样品时，按对角线五点、棋盘式或分层取样，每点取样10株～20株，取样应有代表性。 5.2 检测方法 5.2.1 样品的制备将种苗样品均匀剪取植株茎尖和新叶幼嫩组织，加入石英砂后于低温条件下充分研磨，获得研磨组织物。 5.2.2 DNA?的提取病毒DNA的提取可以采用商用植物DNA提取试剂盒或DNA提取试剂，按照提取步骤和方法进行，或者采用如下标准方法进行： ——从研磨组织物中收集?20g～100g?研磨组织，放置于?1.5L?的离心管内（已经加入?0.65L?的 Lysis?缓冲液），搅拌均匀。每个离心管震荡?30s，然后离心?2in（12000rp/in）； ——将?0.5L?上清液转入一个新离心管中，加入?100μL?乙酸钾缓冲液（3.0，pH5.5）。将离心管反复倒置几次充分混匀后，再离心?2in（12000rp/in）； ——取?0.5L?上清液转入一个新的离心管中（内含?0.5L?异丙醇），将管内液体充分振荡后，离心 5in（12000rp/in）。去除上清液后加入?0.75L?的?70%乙醇溶液，振荡后离心?30s?后去除上清液，此步骤重复?3?次。最后去除上清液后，为?DNA?样品，将其