DB12∕T 1019-2020 猪德尔塔冠状病毒 RT-PCR 检测方法.docxVIP

ICS??65.020.30 B?41 DB12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T?1019—2020 猪德尔塔冠状病毒?RT-PCR?检测方法 RT-?PCR?assay?for?detection?of?porcine?deltacoronavirus 2020?-?12?-?28?发布 2021?-?02?-?01?实施 天津市市场监督管理委员会 发?布 DB12/T?1019—2020 前 言 本标准按照GB/T?1.1-2009给出的规则编写。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：天津市畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：李秀丽、鄢明华、郑丽、路超、田向学、张莉、李富强、江珊、任卫科、董志 民。 I 库七七提供下载DB12/T?1019—2020 库 七 七 w .k w. co m 提 供 下 载 猪德尔塔冠状病毒?RT-PCR?检测方法 1 范围 本标准规定了猪德尔塔冠状病毒（porcine?deltacoronavirus，PDCoV）RT-PCR检测方法的原理、 仪器设备与试剂、样品对照、方法步骤和结果判定等技术内容。 本标准适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中PDCoV核酸的检测。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PDCoV：猪德尔塔冠状病毒（porcine?deltacoronavirus） PCR：聚合酶链式反应（polymerase?chain?reaction） RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reverse?transcription-polymerase?chain?reaction） RNA：核糖核酸（ribonucleic?acid） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic?acid） cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementary?DNA） PK-15细胞：猪肾细胞（porcine?kidney?cell） DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） Taq酶：Taq?DNA聚合酶（Taq?DNA?polymerase） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside?triphosphate） M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloney?murine?leukemia?virus） PBS：磷酸缓冲液（phosphate?buffer?solution） TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（tris?acetate-EDTA?buffer） 3 原理 PDCoV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PDCoV?M基因保守基因 序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延 伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。依据PCR试验结果，判断样品中是否含有PDCoV。 4 主要仪器设备 生物安全柜、组织研磨机、涡旋振荡器、台式低温高速离心机、PCR?仪、电泳仪、凝胶成像系统、 分析天平（精度?0.01g）、超低温冰箱（-80℃）等。 5 试剂与引物 5.1 试剂 1 引物名称 引物序列 引物浓度 扩增产物大小 上游引物P1 5-ATTCTGCTTTGGCTGCTC-3 10?μmoL/L 359?bp 下游引物P2 5-TCCTGTGGCGGATTTC-3 10?μmoL/L 载库七七提供下DB12/T?1019—2020 载 库 七 七 w .k w. co m 提 供 下 Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、DEPC处理的灭菌去离子水、Taq?DNA 聚合酶、dNTP、DL2000?DNA?Marker、核酸染料、磷酸盐缓冲液（PBS，0.01?mol/L，pH?7.2）、TAE电 泳缓冲液、琼脂糖。相关溶液配制方法见附录A。试剂均为分析纯。 5.2 引物 PDCoV?M基因PCR扩增方法所用引物见表1： 表1?? 表1?? PDCoV??M?基因?PCR?扩增方法引物 样品对照如下： ——阳性对照样品：PDCoV?接种的?PK-15?细胞培养物； ——阴性对照样品：正常?PK-15?细胞培养物。 7 方法步骤 7.1 样品的采集及处理 7.1.1 采样工具 1.5?mL离心管、剪刀、镊子和棉拭子，经121（±2）℃，15?min高压灭菌，50℃～60℃烘干备用。 7.1.2 采样方法 肠及肠内容物：选择空肠或回肠肠段，用绳子将肠两端扎紧，用剪刀采集肠及肠内容物等，放入一 次性灭菌容器。 粪便：取发病猪新鲜粪便或者将棉拭子深入肛门转一圈蘸取粪便，将采集后的样本放入盛有0.5?mL PBS溶液的1.5?mL离心管中。 细胞培养物：将待检细胞培养物置