5第三章生物材料的预处理和液-固分离.pptVIP

霉菌的细胞壁较厚，约100~250nm 酵母的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎 （一）机械法 1、匀浆法 2、珠磨法 3、超声波 （三）化学法 1、化学试剂处理 2、酶解法 3、制成丙酮粉 （二）物理法 1、干燥 2、冻融 3、渗透压冲击 二、 细胞破碎方法 机械法 高压匀浆法：适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和 黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物 高速珠磨法：利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由 于研磨作用，使细胞破碎 超声波破碎法：实验室常用。 影响因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等 French Press 1. 高压匀浆法 A.手轮；B.阀杆；C.阀体；D.阀座；E.撞击环 高压匀浆器 利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环，使细胞破碎。 1. 高压匀浆法 细胞在这一系列高速运动过程中经历了 剪切、 碰撞、 由高压（100~200MPa）到常压（0.1MPa）的变化， 从而造成细胞破碎。 高压匀浆器 高压匀浆机 型号：NS3015H　　 意大利GEA Niro Soavi公司生产。 在1000bar的操作压力下破碎大肠杆菌，破碎率90％左右，2次以上的破碎次数可以获得更高的破碎率。 在所有酵母菌破碎中均得到采用，如：酿酒酵母、啤酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵母。   高压匀浆机 2. 高速珠磨法 工作原理： 将进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃珠一起搅拌，由于研磨作用，使细胞破碎，释放出内含物。如图所示。 高速珠磨机 在15-25 kHz的频率下操作。 原理与空化现象引起的冲击波和剪切作用有关。 空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。 3. 超声破碎法（Ultrasonication） 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差，该法在实验室小规模细胞破碎中常用。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。 超声波振荡器 （二）、物理法 1. 干燥法 干燥使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性，同时部分菌体发生自溶。 当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 方法：空气干燥、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥 真空干燥多用于细菌。 2. 冻融法 将细胞放在低温（低于-15℃）下突然冷冻，而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。 由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。 3. 渗透压冲击法 先把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩； 当达到平衡后， 将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂，使产物释放至溶液中。 （三）、化学法 1. 加入化学试剂 （1）用碱处理 （2）用脂溶性有机溶剂 （3）表面活性剂 碱处理：可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分，还可以调节溶液的pH，改变细胞所处的环境，从而改变蛋白质的电荷性质，使蛋白质之间或蛋白与其他物质之间的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取。 脂溶性有机溶剂：如丁醇、丙酮等，它们能溶解细胞膜上的脂类化合物，使细胞结构破坏，而将胞内产物抽提出来。 表面活性剂：破坏细胞膜结构，引起细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。 （三）、化学法 2. 酶解法 利用酶（溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶 等）反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达破壁的目的需与其它方法（辐射、渗透压冲击、反复冻融法等）配合使用。 途径：在细胞悬液中加酶或采用自溶作用; 自溶作用：利用微生物自身产生的酶来溶菌，而不需外加其它 的酶 导致自溶的方法：加热法、干燥法 （三）、化学法 3. 制成丙酮粉 制成丙酮粉：组织经丙酮脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎，使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中。 丙酮粉是微生物或生物组织，有时是蛋白质或酶的提取物，用丙酮脱水的干制品。 制成丙酮粉是防止生物活性物质在水的存在下发生破坏变质的一种保存方法。 三、 细胞破碎率评价 细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： ? ?? ?? ?? ?? ? Y(%)=[(N0-N)/N0]×100 N0－原始细胞数