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dpph法测定葡萄籽原花青素抗氧化清除自由基的能力 开发和开发天然植物氧化反应剂，以消除氧化自由基对身体的损害，是当前药理学和食品研究的重点。流行病学研究发现,欧美等发达国家的心脑血管发病率和死亡率都居世界首位,而法国却与此相反。调查发现,法国红葡萄酒消费量居世界首位,红葡萄酒中含有大量多酚类物质——原花青素,它们可以有效地清除有害的氧自由基,抑制红细胞膜和低密度脂蛋白脂质过氧化,促进内皮细胞松驰因子的形成,防止血小板凝聚,防止心脑血管疾病。 国内外研究表明,植物中的原花青素(也称缩合单宁)具有显著的抗氧化、抗基因突变、消炎、抑菌、清除超氧阴离子自由基、羟基自由基、减少脂质过氧化自由基、抑制脂质过氧化等作用。其作用机理主要是原花青素能够与自由基交换一个氢原子或电子,与欲清除的自由基有近似的氧化还原电位,生成的自由基通过离域化而稳定。由于原花青素分子结构上有多个酚羟基,它们可以与暂存性自由基(transient radical)结合,生成稳定的自由基(stable radical),螯合启动脂质过氧化的金属离子,参与抗氧化的协同作用。通过终止自由基链式反应,螯合金属离子,清除活性氧(与封闭系统中的氧反应),原花青素可以减少或消除氧自由基对机体组织和器官的损害作用。关于葡萄籽原花青素清除自由基能力的测定已有一些报道,作者用DPPH法测定葡萄籽原花青素抗氧化、清除自由基能力。 1 材料和方法 1.1 -diphenyl-1-picryl 葡萄籽原花青素:葡萄籽粉先经乙醇提取,然后用HP-2MGL大孔吸附树脂纯化制备;2,2-二苯基-1-苦味肼基自由基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl,free radical 简称DPPH·):纯度90%, 美国Sigma-Aldrich公司产品;HP-2MGL大孔吸附树脂:日本三菱株氏会社产品;SephadexLH-20:瑞士法玛西亚公司产品;维生素C,芸香糖苷(芦丁):中国医药(集团)上海化学试剂有限公司产品;甲醇等试剂均为分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 [dpph]自由基的替代效果 二苯基苦味肼基自由基[DPPH·]是一种稳定的以氮为中心的自由基,在515 nm波长处有最大吸收。[DPPH·]甲醇溶液呈紫色,其浓度与吸光度呈线性关系。在[DPPH·]甲醇溶液中加入葡萄籽原花青素后,原花青素可以与[DPPH·]自由基结合或发生替代,使[DPPH·]自由基数量减少,溶液颜色变浅,表现为:其在515 nm波长处的吸光度不断减小,直至达到稳定。因此,可以通过在515 nm波长处检测葡萄籽原花青素对[DPPH·]自由基的清除效果,计算其抗氧化能力。 1.2.2 标准溶液的配制 准确称取[DPPH·]2.5 mg,用甲醇定容到100 mL,配制成质量浓度为2.5×10-2mg/mL的标准溶液,置冰箱中保藏备用(现用现配)。分别取0、2、4、6、8、10 mL标准溶液,用甲醇定容至10 mL,最终质量浓度分别为0,5,10,15,20,25 μg/mL。 测定上述标准溶液在515 nm波长处的吸光度,制作标准曲线(见图1)。其线性回归方程为: Y= 0.022X-0.0032,R2=0.9997。 1.2.3 葡萄籽原花青素的纯化 称取1 000 g真空干燥葡萄籽,粉碎成40目左右的粉末,用体积分数70%的乙醇溶液搅拌提取3次合并提取液,离心过滤,得澄清的滤液。滤液在40℃以下减压浓缩,经喷雾干燥,得葡萄籽原花青素粗粉(Crude Grape Seed Proanthocyanidin,简称GSP )。称取一定量粗提物,用水溶解后,过滤,上HP-2MGL大孔吸附树脂柱,葡萄籽原花青素吸附在树脂柱上,用去离子水洗脱蛋白、糖等杂物后,依次用体积分数30%、50%、70%的乙醇洗脱,将洗脱液真空浓缩并冷冻干燥,分别得到葡萄籽原花青素纯化物1、2、3干粉(简称GSPP1、GSPP2、GSPP3)。将GSPP3用甲醇溶液溶解,再用Sephadex-LH20吸附柱纯化,最后用体积分数50%的丙酮溶液洗脱,得到较纯的葡萄籽原花青素纯化物4(简称GSPP3-SP)。 1.2.4 [dpph]残留率测定 葡萄籽原花青素对[DPPH·]自由基清除能力的测定参阅Brand-William(1995)。取适量的葡萄籽原花青素分级产品,以维生素C和芦丁作对照样。以甲醇为溶剂,配制不同浓度的葡萄籽原花青素,分别取0.1 mL样液,加入3.9 mL质量浓度为25 mg/L[DPPH·]标准液(现用现配),以甲醇替代样液为空白。将混合溶液摇匀,用比色皿,在515 nm波长处,测定其在不同时间的吸光度值,根据标准曲线可以换算成[DPPH·]的质量浓度,从而计算出[DPPH·]残留率。根据[DPPH·]残留