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苦荞FtF3H基因的克隆及其在原核细胞中的表达 　　摘要：通过苦荞转录组和基因组数据，挖掘出与苦荞类黄酮代谢有重要关系，催化生成类黄酮3-羟化酶的基因 FtF3H1。经植物花朵RNA提取及反转录，成功克隆出目的基因，并在原核细胞中成功表达出与目标物相对分子质量大小一致的蛋白质。拟通过对转录组与基因组的数据，减少实验步骤，发掘更多更全面的信息。 关键词：苦荞；转录组；基因组；类黄酮3-羟化酶 前言 　　我国西南地区作为国际公认的荞麦起源地，其复杂多样的地理环境和气候类型孕育了丰富的荞麦资源。目前，我国有苦荞（Fagopyrum tataricum）、甜荞（F. esculentum）和金荞（F. cymosum）三个种的栽培类型，其中苦荞和甜荞在我国的栽培历史长达几千年并被大面积种植，在我国农业发展史上具有重要地位[1]。苦荞由于其生育期短，耐旱、耐瘠薄，富含生物类黄酮，是重要的保健食品资源。全国苦荞常年种植面积500-600万亩，总产60-65万吨，主产区包括四川、云南、贵州、重庆等地[2]。 　　研究发现，苦荞中含有大量的类黄酮物质，且含量远高于其他品种的普通荞麦[3]。由于黄酮类化合物对人体健康的多种益处，人们对其研究的兴趣越来越大。黄酮类化合物的生物利用度、代谢和生物活性取决于其构型、羟基总数、核结构上官能团的取代[4]。黄酮类化合物由许多的多酚化合物组成，具有-苯并吡喃酮结构，由类苯基丙烷途径合成的，在植物中普遍存在。现有研究表明，包括类黄酮化合物在内的二级酚类代谢物在各种药理学活动中起重要作用[5]。黄酮类化合物通过清除自由基和/或螯合金属离子来调节其抗氧化作用[6]。类黄酮具有诱导人类保护酶系统的能力。大量研究表明，黄酮类化合物对许多传染病（细菌和病毒疾病）和退行性疾病（如心血管疾病、癌症和其他与年龄有关的疾病）具有保护作用[7]。 　　在类黄酮合成途径中，类黄酮3-羟化酶（F3H）催化二氢山奈酚、山奈酚和柚皮素的B环3位置羟基化，生成二氢槲皮素、槲皮素及圣草酚，这三种化合物是合成B环3，4二羟基化黄酮类化合物的重要中间体[8]。F3H催化的反应在一定程度上控制着总黄酮的代谢流，被认为是类黄酮化合物物合成途径中关键的限速酶。现有研究表明，F3H基因的表达水平决定了黄酮类化合物的种类及含量，是类黄酮化合物生物合成的重要调控点[9]。　　细胞色素P450家族75（Cytochrome P450, CYP75）在彩色类黄酮的生物合成中发挥着重要作用，花青素给花带来了从橙色到红色、紫色和蓝色的各种颜色。花青素B环上的羟基（花青素的发色团和前体）的数量影响着花青素的颜色——含量越多颜色越蓝[10]。羟基化模式由CYP75蛋白决定：类黄酮3-羟化酶[F3H，EC: 2]和类黄酮 3，5-羟化酶[F35H，EC: 1]，它们分别属于CYP75B和CYP75A亚家族。这两种酶都具有广泛的底物特异性，能够催化黄烷酮、二氢黄酮醇、黄酮醇和黄酮的羟基化反应[11]。CYP将它们的多种配体结合在一个隐蔽的疏水活性位点上，该活性位点通过两个柔性螺旋及其连接环形成的基质通道进入[12]。 　　本研究基于苦荞转录组数据，拟克隆苦荞编码F3H蛋白的基因并进行分子鉴定，进一步采用原核表达重组FtF3H1 的方法鉴定克隆结果。本研究可为明晰苦荞黄酮合成代谢的关键步骤和瓶颈因素提供参考，为转录组数据的生物实验提供实际应用数据。 材料与方法 供试材料 研究材料“西荞2号”种子由西昌学院王安虎教授友情赠送。 　　将苦荞种子在水中浸泡过夜，移至25℃恒温箱中培养，待其根长至2 cm左右时，移栽至四川农业大学生命科学学院生物化学与分子生物学植物培育室里进行培养，待苦荞开花时，剪取成熟的花朵，样品收集后迅速冷冻在液氮中，保存在 -80℃冰箱中直到分析。 　　克隆宿主菌大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、E. coli BL21(DE3)感受态细胞购于北京天根科技公司； pGEX4T-1表达载体由四川农业大学生命科学学院生物化学与分子生物学实验室保存。 仪器设备 　　 PCR仪（BIO RAD-T100 Thermal Cycler 1861096）、电泳仪（BIO RAD）、凝胶成像系统（BIO RAD-ChemiDoc XRS+）、-80℃低温冰箱（Thermo-Revco? UxF -86℃ 立式超低温冰箱）、恒温摇床（ZWY-211C）等。 主要试剂 　　植物RNase固相清除剂、柱式植物RNAout 2.0试剂盒、反转录试剂盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser、非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒（ClonExpress?II One Step Cloning Kit）、限制性内