细胞迁移侵袭试验技术(Transwell).docxVIP

迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层 培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就 可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径 8μm，没包被胶的(Coster和 Corning 公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板 24 孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD 公司的Matrigel，无血清 DMEM ，(1% 胎牛血清)DMEM 和 1640 培养基，DMEM 完全培养基，1640 完全培养基（也可加到20% 血清），无菌PBS ，棉签，胰酶，4% 多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1% （g/ml）PBS 结晶紫） 步骤和流程 基质胶铺板： 用 BD 公司的Matrigel ：1 8（根据细胞产生mmp 的量来决定）稀释，包被Transwell小室 底部膜的上室面，置 37 ℃30min 使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 －24h ，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用 PBS 洗 1－2 遍），用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至 5×105/ml。 接种细胞 ①取细胞悬液 100 l加入Transwell小室。 ②24 孔板下室一般加入 600 l含 20%FBS 的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养 12 －48h （主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h 较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS 洗 2 遍，甲醇固定30 分钟，将小室适当风干。 0.1% 结晶紫染色 20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS 洗 3 遍。 400 倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料 Transwell chamber: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Corning) 细胞培养相关试剂：无血清培养基，10％血清培养基，PBS，0.02％EDTA 固定液：甲醇 染色液：Giemsa 染液 封片剂：中性树胶 其他：小镊子，棉棒，载玻片，盖玻片操作步骤 所有细胞培养试剂和 Transwell chamber 放在 37℃温育； 待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用 PBS 和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为 2×105 /ml； 在下室（即 24 孔板底部）加入 600－800μl 含 10％血清的培养基，上室加入 100－150μl 细胞悬液，继续在孵箱培养 24 小时； 用镊子小心取出 chamber，吸干上室液体，移到预先加入约 800μl 甲醇的孔中，室温固定 30 分钟； 取出 chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约 800μl Giemsa 染液的孔中，室温染色 15－30 分钟； 轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出 chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞； 用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片； 显微镜下取 9 个随机视野计数，统计结果。 注意事项 根据待测细胞体积大小选择合适孔径的 chamber。常用的为 8.0-μm 孔径（如 AGS 细胞），如果细胞体积较大可以考虑用 10-μm 孔径； 根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规 24-well chamber 接种细胞数约为 2≈5×104/well，迁移时间 12≈36 小时； 由于 Corning 公司的 24-Transwell 内含 12 个独立的 chamber，为了避免操作污染，每次实验可预先另准备一块 24 孔普通培养板（Corning）； 如果细胞迁移能力较弱，下室液体可用3T3 细胞无血清培养 24 小时获得的上清加 50μg/ml FN（Fibronecti