稳定细胞株筛选实验.docVIP

(完整word版)稳定细胞株筛选实验

(完整word版)稳定细胞株筛选实验

(完整word版)稳定细胞株筛选实验

稳定细胞株筛选实验

本实验使用过表达humanOct-4—EGFP的慢病毒感染HeLa细胞。该病毒的表达框为pLenti—CMV-Oct—4-EGFP-3FLAG—PGK—Puro：CMV启动子驱动Oct-4—EGFP基因的表达，同时由PGK启动子驱动puromycin抗性基因的表达。在感染HeLa细胞72h后，通过加入并维持2μg/μL的puromycin杀死未被有效感染的细胞。从而在puromycin药物的维持下最终获得Oct-4-EGFP稳定表达的混合稳定株。

关键词:Oct—4—EGFP,稳定细胞株，HeLa，慢病毒

一、实验原理

外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达(永久表达）.前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上,使宿主细胞可长期表达目的基因。建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。最常用的抗性标记基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素(puromycin），常用HygromycinB、G418和puromycin进行选择性筛选.传统的稳定株筛选方法需