01-生物化学实验--凯氏(Kjeldahl)微量定氮法测定血清蛋白质含量.docVIP

凯氏（Kjeldahl）微量定氮法测定血清蛋白质含量

【目的】

1．掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括未知样品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。

2．熟悉微量凯氏定氮法的原理。

【原理】

凯氏定氮法是蛋白质含量测定的经典方法，它是根据蛋白质分子中含氮量来测定的，各种蛋白质含氮量比较近似，平均约为16％，即1g氮相当于6.25g蛋白质。由测定出的氮量即可换算出蛋白质含量。

血清蛋白质或其它有机含氮物与浓硫酸加热进行消化(氧化)时，其中碳、氢、氧元素分别被氧化为二氧化碳和水，而氮原子则转变成氨，后者与硫酸结合生成硫酸铵，留在溶液中，为了加速有机物质的氧化分解，在消化时加入硫酸铜做为催化剂，加入硫酸钾以提高消化液的沸点。硫酸铵与氢氧化钠作用，放出氨，通过水蒸气蒸馏将氨带入接收瓶中被硼酸溶液吸收，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，用已知浓度的标准盐酸滴定，直至原来溶液中氢离子的浓度恢复，即指示剂变为原来的颜色。根据所消耗的标准盐酸量，即可计算出样品中的总氮量。化学反应式如下：

1．消化

含氮化合物+H2SO4—→CO2↑+H2O+(NH4)2SO4+SO2↑

2．蒸馏

(NH4)2SO4+2NaOH—→2NH4OH+Na2SO4

NH4OH—→NH3↑+H2O

3NH3+H3BO3—→(NH4)3BO3

3．滴定

(NH4)3BO3+3HCl—→3NH4Cl+H3BO3

以上测定为样品中的总氮量，由总氮量减去非蛋白氮，即为蛋白质含氮量，再乘以6.25即为血清蛋白质含量。

【器材】

1．电炉

2．铁三角架

3．酒精灯

4．锥形瓶

5．消化管（凯氏烧瓶）

6．滴定管

7．微量凯氏定氮器

8．刻度吸量管

9．玻璃珠

10．漏斗

11．血清

【试剂】

1．硫酸钾粉末

2．12.5％硫酸铜水溶液

3．浓硫酸

4．2％硼酸水溶液

5．混合指示剂

取0.1％溴甲酚绿乙醇溶液10ml与0.1％甲基红乙醇溶液4ml混合

6．30％氢氧化钠溶液

7．0.0lmol/L盐酸标准溶液

【操作】

一、消化

取消化管二支，标明测定管与空白管，按下表进行操作：

试剂（ml）

测定管

空白管

血清

0.10

-

蒸馏水

-

0.10

K2SO4粉末（g）

0.1～0.2

0.1～0.2

12.5%CuSO4

0.3

0.3

浓H2SO4

1.2

1.2

玻璃珠(个)

1

1

混匀，置于电炉上加热消化（图3-1），开始有水蒸气逸出，继而溶液呈现棕色并冒出白烟(SO3)，此时火力应减小，并在管口上盖一小漏斗，以免硫酸损失过多，再继续消化至溶液变为澄清的蓝绿色，即消化完毕(此过程约需25分钟左右)，冷却后加水3.8ml，使总量成为5ml(内有1.2ml硫酸)，混匀，准备蒸馏。

图3-1消化装置示意图

二、蒸馏

1．蒸馏器的结构和用法

蒸馏器有多种，但大同小异。用前需熟悉其使用方法。本实验所用蒸馏器如图3-2所示：

图3-2微量凯氏定氮器结构示意图

P1为出水开关，P2为入水开关，A为蒸气发生室，B为蒸馏室，与出气管M相通。B室内有Y形管，一端与A室相通，另一端经P3与漏斗D相连，经此可将样品和试剂加入B室，E为进水管，接水龙头，F为指形冷凝管，H为盛有定量硼酸溶液的锥形瓶，以吸收氨。水经E、F、G、K而流出，蒸馏时B室加入消化好的样品及氢氧化钠，二者反应产生氨，A室因加热而产生的水蒸气经Y管进入B室，并将氨一起带出，经冷凝由M管进入锥形瓶中被酸吸收。

将洗干净的微量凯氏定氮器安装妥当，把E管接水龙头，并关闭P1、P2、P3各塞，打开水源，水则由E→F→G→K缓缓流出(水不宜开的过大，以免水从G管溢出)。放开P2，水流入A室，并让少量水流入B室，然后塞住管口G，放开P1，此时B室内水应被吸出，否则应检查各接头处是否漏气。

2．蒸馏

（1）打开水笼头和P2，使水经E→F→G→P2进入A室，水约至瓶下球形部分的2／3处，即关闭P2。