实验五--人GAPDH基因PCR扩增.docVIP

实验五人GAPDH基因PCR扩增

1．目的与要求：掌握PCR扩增的原理及方法。

2．实验原理

PCR(polymerasechainreaction)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由①变性(denature)；②退火(annealing)；③延伸(extension)三步组成一个循环,通过多次循环可使目的DNA呈2n指数迅速扩增。一般经过30个左右循环PCR扩增产物可达到最大量的扩增。人GAPDH基因是一个管家基因，我们通过设计并合成PCR扩增的上下游引物来作为PCR反应的引物扩增人GAPDH，扩增长度为494bp。

3．仪器设备：超纯水系统、PCR仪、离心机、制冰机、蜗旋震荡器、移液枪等。

4．实验材料：0.2ml带盖聚乙烯试管、量筒、烧杯、一次性枪头等。

5．试剂：

5.1DNA模板。

5.2dNTP。

5.3上、下游引物。

5.4r-Taq酶。

5.510×PCRbuffer

5.6超纯水

6．实验步骤：

6.1将-20oC保存的DNA在室温下溶解，混匀备用。

6.2在冰浴上,按以下次序将各成分加入无菌0.2ml离心管内：

试药剂量(μl)总体系20μl

10×PCRbuffer1μl

dNTPmix2μl

上游引物(0.5μm)1μl

下游引物1ul

Taq酶(2U/μl)0.125μl

DNA模板(10ng/μl)1μl

超纯水13.875μl

6.3将上述混合液混匀后稍加离心,立即置于调整好反应程序和预热的PCR仪上进行扩增。(PCR反应程序:94℃4min后,进入循环扩增阶段,94℃40s,60℃40s;72℃45s,循环30

6.4将扩增完后的离心管保存在-20℃