DB15_T 3279-2023 苜蓿根腐病锐顶镰刀菌鉴定方法.docxVIP

ICS?65.020.01

CCS?B?05

15

内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准

DB15/T?3279—2023

苜蓿根腐病锐顶镰刀菌鉴定方法

Identification?of?fusarium?acuminatum?of?alfalfa?root?rot

2023-12-29?发布 2024-01-29?实施

内蒙古自治区市场监督管理局 发?布

DB15/T?3279—2023

前 言

本文件按照GB/T?1.1—2020《标准化工作导则??第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC?19）归口。

本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、内蒙古自治区

乡村振兴研究中心。

本文件主要起草人：史志丹、孙红霞、丁海君、房永雨、杨永青、郭呈宇、伊风艳、燕梦娇、郭晨、

孙林、刘思博、张英、刘亚东、李国强。

I

DB15/T?3279—2023

苜蓿根腐病锐顶镰刀菌鉴定方法

1 范围

本文件规定了苜蓿锐顶镰刀菌根腐病鉴定的主要仪器与用具、主要试剂与材料、实验室检测、结果

判定。

本文件适用于苜蓿锐顶镰刀菌根腐病的室内鉴定。

2 规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

锐顶镰刀菌根腐病?fusarium?acuminatum?root?rot

由锐顶镰刀菌（Fusarium?acuminatum）引起的苜蓿根腐病，在感染初期，苜蓿的根皮附近会出现

褐色或暗褐色的坏死斑，根系毛根减少，部分叶子出现黄叶，发病严重时叶片枯黄，植株根部的中柱腐

烂霉变，并发生坏死，根茎出现中空，侧根出现大量腐烂坏死，分枝减少。

4 主要仪器与用具

光学显微镜、摇床、培养箱、超净工作台、高速冷冻离心机、PCR仪、培养皿、酒精灯、血球计数

板、解剖刀、接种针、移液器、枪头、离心管。

5 主要试剂与材料

试剂

5.1.1?次氯酸钠。

5.1.2?无水乙醇。

5.1.3?硫酸链霉素(500?mg/mL)。

5.1.4?真菌基因组提取试剂盒。

5.1.5?PCR?SuperMix。

5.1.6?凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，Loading?Buffer，DL2000?DNA?Marker。

培养基

5.2.1 水琼脂培养基（WA:?Water?Agar）：琼脂粉?15?g，加蒸馏水定容至?1000?mL，121?℃高压湿热

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灭菌?20?min。

5.2.2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA:?Potato?Dextrose?Agar）：马铃薯?200?g，葡萄糖?20?g，琼脂

粉?15?g，加蒸馏水定容至?1000?mL，121?℃高压灭菌?20?min。

5.2.3 马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB:?Potato?Dextrose?Broth）：马铃薯?200?g，葡萄糖?20?g，加

蒸馏水定容至?1000?mL，121?℃高压灭菌?20?min。

5.2.4 绿豆琼脂培养基（MBA:?Mung?Bean?Agar）：绿豆粉?60?g，琼脂粉?15?g，加蒸馏水定容至?1000

mL，121?℃高压灭菌?20?min。

6 实验室检测

病原菌的分离和纯化

6.1.1 病原菌的分离

从苜蓿田采集患有根腐病的典型病株。用水清洗样品表面的砂砾和土壤，从根部病健交界部位切成

约0.5?cm×0.5?cm的小组织块，用75%酒精和1%次氯酸钠分别处理3?min和5?min，无菌水清洗5次。把表

面消毒的发病组织放在PDA培养基上25?℃培养，见附录A中的图A.1。

6.1.2 病原菌的纯化

待PDA培养基长出菌落后取菌落边缘的菌丝转接3次后再进行单孢分离获得纯化菌株用于后续试验，

见附录A中的图A.1。用30%灭菌甘油将分离鉴定后的菌株于-80?℃保存，对不需长期保存的菌株及时灭

活处理。感染苜蓿根腐病的样品保存于4?℃冰箱中，以备复核。

菌落培养特性和病菌形态特征鉴定

6.2.1 锐顶镰刀菌在?PDA?培养基生长形态

锐顶镰刀菌在PDA平板上菌丝呈粉红色绒毛状，生长到后期，颜色逐渐加深变成桃红色，菌丝有隔

且具分支，见附录A的图A.2。

6.2.2 锐顶镰刀菌分生孢子

锐顶镰刀菌小型分生孢子数量较少，呈长椭圆形，0～1个分隔，大小为6.8?μm～14.0?μm×3.5?μm～

4.9?μm。大型分生孢子数量较多，弯刀型，中间较宽、较胖，两端稍尖并稍弯曲，2～5个分隔，大小为

18.2?μm～38.5?μm×3.9?μm～6.3?μm，见附录A中的图A.3。

分子鉴定

6.3.1 病原菌基因组?DNA?的提取

病原菌菌株在25?℃下PDA平板上生长5～7?d后，转接至装有50?