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农杆菌介导转化的程序外植体的预培养农杆菌菌体的活化侵染共培养转化子的筛选培养转化植株的再生转化子的鉴定外植体预培养菌液制备侵染共培养选择培养分子鉴定田间试验遗传分析性状鉴定整合整合外植体的预培养：一般以2-3天为宜。预培养有利于细胞分裂，从而提高外源基因的瞬时表达和转化率；驯化作用；减少杂菌污染率；利于外植体与培养基的平整接触。外植体的农杆菌接种：菌液浓度一般为OD600=0.5-0.7之间；浸泡后的外植体要在无菌滤纸上吸干，以除去过量的菌体。农杆菌与外植体共培养：在固体培养基表面加一层滤纸，有利于控制外植体上农杆菌过度增殖。共培养时间必须长于16h，一般为2-3天。在共培养培养基中加入As(乙酰丁香酮，细胞创伤诱导分子)或采用tomatofeederplates均可提高转化率。外植体脱菌及选择培养：常用的脱菌抗生素有羧苄青霉素（carbenicillin）、头孢霉素（cefotaxine）及羧噻吩青霉素（timentin）。常用的选择抗生素如Km、HPT、bar等。转化植株的再生转化株的分子鉴定（PCR、Southernblot、Northernblot、Westernblot、实时定量PCR）转化株的形态、性状观察（株形、分枝、开花结果习性等）转化株后代遗传分析根癌农杆菌Ti质粒转化的方法整体植株接种共感染法叶盘转化法原生质体共培养转化法★农杆菌介导转化的优缺点优点：成功率高，效果好；转移的外源基因常为单拷贝整合，很少会发生甲基化和转基因沉默，遗传稳定，而且多数符合孟德尔遗传规律；费用低，方法简单易操作；寄主范围广，几乎所有的双子叶植物都可采用此法，尤其近年来在一些单子叶植物上也取得成功（已有7个科的20多种单子叶植物转化获得成功）。不足之处：农杆菌介导的转化主要应用于双子叶植物，还有少数的单子叶植物；而大多数单子叶植物，尤其是禾本科作物对农杆菌不敏感，限制了它的应用；另外，农杆菌侵染后的外植体再生阶段脱菌比较困难，需要长期使用抗生素，给实验带来烦恼。PEG介导基因转化PEG介导基因转化是Davey等（1980）和Krens等（1985）首先建立。PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鸟氨酸（pLO)、磷酸钙及高PH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。★PEG介导基因转化法步骤（1）Ti质粒DNA提取（2）原生质体分离（3）转化培养（4）转化培养同时加入运载DNA（即鲑鱼精DNA或小牛胸腺DNA）（5）离心收集原生质体或用钙离子溶液使PEG逐步稀释（6）将原生质体培养于选择培养基上或不加选择压力按一般方法培养（7）当细胞团长到一定大小时将细胞团转移至含选择压力的培养基中筛选转化细胞★PEG法的特点避免嵌合转化体的产生；对细胞伤害少，而且转化顺利；其转化的原生质体易于选择转化体；原生质体转化是理论研究的极好的实验系统；受体植物不受种类的限制。PEG法不足之处建立原生质体再生系统十分困难，从而阻碍了PEG法的应用；转化率低；从原生质体再生的无性系植株变异较大，因此通过PEG法转化后的转基因植株将产生更多的无性系变异。电击法介导基因转化电击法是利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电击穿孔”（electroporation),形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，李宝健等于1985年首次将其应用于植物细胞的基因转化。★电击法介导基因转化步骤（1）分离原生质体加入电击缓冲液重悬，并离心3分钟去掉上清液，再加入适量的电击缓冲液，计数，将原生质体密度调节到1×106—2×106个/ml（2）加入10μg/ml质粒DNA和50μg/ml鲑鱼精子DNA，混合后分装于电击反应槽内（3）冰浴5min（4）选择不同参数电击（5）600r/min离心3min除去电击缓冲液，用液体培养基洗涤（6）将原生质体包埋于固体培养基中，28℃黑暗条件下选择培养★电击法特点电击法除了同样具有PEG原生质体转化的优点外，还具有操作简便，DNA转化效率较高，特别适于瞬时表达的研究。缺点是造成原生质体的损伤，使植板率降低，且仪器也较昂贵。基因枪法介导基因转化基因枪法（particlegun)又称微弹轰击法（microprojectileorbiolisticbombardment)。最早是由美国康奈尔（Cornell)大学的Sanford等（1987）研制出火药引爆的基因