一次使用卫生用品中金黄色葡萄球菌检验 实时荧光PCR法 征求意见稿.docx

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T/NAIAxxx-xxxx

一次性使用卫生用品中金黄色葡萄球菌检验实时荧光PCR法

1范围

本文件规定了一次使用卫生用品中金黄色葡萄球菌的实时荧光PCR检测方法。

本文件适用于一次性使用卫生用品中金黄色葡萄球菌的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6882-2008分析实验室用水规则和试验方法

GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测

GB/T19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求

GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准

3术语和定义

3.1术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

3.2略缩语

DNA(deoxyribonuleicacid):脱氧核糖核酸

Nuc(thermostablenucleasegene):耐热核酸酶编码基因

PCR(polymerasechainreaction):聚合酶链式反应

Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数

4原理

一次性使用卫生用品样品经扩增培养后,提取增菌液中DNA,以提取的DNA为模板,以金黄色葡萄球菌中(Nuc)基因中相对保守且高度特异的引物和探针进行目标物的实时荧光PCR扩增,根据Ct值判断样品中是否含有金黄色葡萄球菌。

5试剂和材料

试剂的配制及试验中的操作规范应按GB/T27403的规定执行。

除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

4.1试剂

5.1.1SCDLP液体培养基:见附录A.1。

5.1.2PCR扩增引物序列:见附录B.1。

5.1.3荧光探针序列见附录B.1。

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T/NAIAxxx-xxxx

5.1.42X荧光定量PCR预混液。

5.1.5商品化DNA抽提试剂盒。

5.1.6金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌标准菌株:来源自国家认可的菌种保藏机构。

4.2耗材

5.1.1离心管:200μL、1.5ml、5mL、10mL。

5.1.2PCR反应管:单管、八联管或96孔PCR微孔板。

6仪器和设备

6.1分析天平:感量0.01g。

6.2微量可调移液器:单道:1~10μL、10~100μL、1~1000μL。

6.3恒温水浴锅。

6.4涡旋仪。

6.5冷冻高速离心机。

6.6高压灭菌锅。

6.7超净工作台。

6.8二级生物安全柜。

6.9实时荧光定量PCR仪。

6.10恒温培养箱:36±1℃。

6.11核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.12普通冰箱:4℃,-20℃。

7实验操作步骤

7.1取样

在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的至少3个包装,从每个包装中取样,准确称取10±1g样品。剪碎后加入200mL无菌生理盐水中,充分混匀,得到一个生理盐水样液。液体产品直接用原液作为样液。

7.2增菌

取样液(6.1)5mL,加入到50mLSCDLP培养液中,充分混匀,置于35℃±1℃培养箱中培养24h。

7.3模板DNA的提取与制备

7.3.1从样品增菌液(7.2)表层吸取1mL增菌液。离心收集细菌(4000rpm/min,10min),去上清液。加入600μL核酸裂解液,重悬浮细菌。100℃水浴5min后冷却至室温。12000rpm/min离心3min,将上清液移至干净的1.5mL离心管中,加入0.8倍体积异丙醇,置于4℃冰箱静置1h,12000rpm/min离心2min,去上清液。加入200μL70%乙醇轻柔倒置洗涤2~3次,,12000rpm/min离心2min去上清,风干10~15min,加入100μL无菌双蒸水重悬后于4℃保存,如不能即时检验,提取后DNA放置于-20℃冰箱保存备用。

7.3.2试剂盒法。从样品增菌液(7.2)表层吸取1mL增菌液,离心收集细菌(4000rpm/min,10min),按照商品化细菌基因组提取试剂盒说明书进行细

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