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主要内容1.RT-PCR基础知识2.RNA提取要点3.逆（反）转录注意事项4.Qrealtime–PCR分析

PCR基础知识PCR定量PCR实时荧光定量PCRRT-PCR定量PCR的原理定量PCR的用途定量PCR的基本流程

用途GWAS

流程实验设计引物设计及合成结果整理数据分析Realtime-PCR反转录cDNA基因组DNA去除TotalRNA提取

TotalRNA提取1.样品的保存2.试剂的选择3.操作的细节4.RNA质与量的检测及保存

样品的保存

试剂的选择广谱RNA提取试剂小RNA提取试剂体液RNA提取试剂体液miR-RNA提取试剂病毒、细菌、多糖多酚植物RNA提取试剂

操作速度质量全程低温（cen）液氮使用器械耗材准备个人防护实验环境手法得当DEPC快、冷、准、细细节决定一切

操作细节

细节总结

RNARNA质与量的验证浓度完整性纯度琼脂糖凝胶电泳（TBE）沉降系数紫外分光光度计、荧光光度计

反转录注意事项

加样（顺序、预混、低温、涡旋、离心）上机（程序、位置、手法）cDNA的保存（-20℃、-80℃）

Qrealtime-PCR试剂选择与保存（SyberddH2OPrimer）操作要点结果分析注意事项

试剂保存SyberGreenⅠⅡ/FAM:4℃、-20℃、-80℃（白色沉淀处理）ddH2OPrimer(稀释、保存、顺序、量)cDNA(用量选择适当—决定Ct值)

结果分析---扩增无峰值

扩增有杂峰

扩增有杂峰填充好的Needleman-Wunsch表格

扩增有杂峰欧洲生物信息学研究所BLAST服务器的用户界面

扩增有杂峰

扩增有杂峰

扩增效率有异常

注意事项

不经一番寒彻骨哪得梅花扑鼻香天道酬勤众志成城衣带渐宽终不悔为伊消得人憔悴

请提出宝贵的改进意见！谢谢大家！

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