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玉米矮花叶病毒检疫鉴定方法

1范围

本文件规定了玉米矮花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法。

本文件适用于禾本科植物植株及种子中玉米矮花叶病毒的检疫鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4玉米矮花叶病毒分类信息

中文名：玉米矮花叶病毒

学名：maizedwarfmosaicvirus。

异名：Maizemosaicvirus、SugarcanemosaicvirusJohnsongrassstrain

分类地位：马铃薯病毒目（Patatavirales）马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）。

玉米矮花叶病毒的其它信息参见附录A。

5方法原理

玉米矮花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据玉米矮花叶病毒与抗体

之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DoubleAntibodySandwichEnzyme

LinkedImmunosorbentAssay，DAS-ELISA）；依据玉米矮花叶病毒的基因组特征建立RT-PCR和荧光

RT-PCR检测方法；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有玉米矮花叶病毒。

6试剂、仪器设备及用具

6.1试剂

除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。

DAS-ELISA试剂应符合附录B中的B.1；

RT-PCR试剂应符合附录C中的C.1；

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荧光RT-PCR试剂应符合附录D中的D.1。

6.2仪器设备

高速冷冻离心机、电子天平、PCR仪、荧光PCR仪、水平电泳系统、-20℃低温冰箱和-80℃超低温

冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、分

光光度计、酶标仪等。

6.3用具

酶联板、可调移液器（2.5μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）、移液器吸头、1.5mL

离心管、研钵等。

7样品准备

7.1植物材料制样

待测样品为植物材料（小苗或叶片）时，挑选有疑似症状的部位单独取样编号，症状描述见附录A；

未表现症状的植物材料分组（2-3份植物材料为1组）编号，采集的每组样品进行混合。相关材料按附录

方法进行样品制备

7.2种子制样

待检测样品为种子时，挑选皱缩、畸形、未成熟的种子单独检测；未表现症状的种子随机取样后混

合制样。所取种子研磨成粉后，称取0.5-1.0g，加入样品抽提缓冲液（B.1.5），离心取上清即为待检样

品，用于ELISA或核酸提取；或称取0.1g干粉样品提取总RNA后用于RT-PCR、实时荧光RT-PCR检测。

8检测鉴定

8.1DAS-ELISA测定

把制备的样品上清液加入已包被玉米矮花叶病毒抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样

品平行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染玉米矮花叶病毒的植物组织作为阳性对照，

样品提取缓冲液作为空白对照；其中阴性对照的植物种类和材料（如叶片）应尽量与检测样品相一致。

具体操作按照附录B规定的方法进行。

8.2RT-PCR检测

RT-PCR检测阴性和阳性对照设置同8.1，灭菌双蒸水（ddHO）作为空白对照。分别提取样品和对

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照的总RNA后进行RT-PCR检测，具体操作按照附录C规定的方法进行。

8.3荧光RT-PCR检测

荧光RT-PCR检测阴性和阳性对照设置同8.1，灭菌双蒸水（ddHO）作为空白对照。分别提取样品