人皮肤T细胞虏获趋化因子CTACKCCL27ELISA试剂盒.docx

人皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK/CCL27)ELISA试剂盒

本试剂盒仅供研究使用。

检测范围：1pg/ml-40pg/ml

使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆相关液体样本中人皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK/CCL27)含量。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK/CCL27)水平。用纯化的人皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK/CCL27)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK/CCL27），再与HRP标记的人皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK/CCL27)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK/CCL27)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK/CCL27)浓度。

试剂盒组成

1 30倍浓缩洗涤液 20ml×1瓶 7 终止液 6ml×1瓶

2 酶标试剂 6ml×1瓶 8 标准品（80pg/ml） 0.5ml×1瓶

3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶

4 样品稀释液 6ml×1瓶 10 说明书 1份

5 显色剂A液 6ml×1瓶 11 封板膜 2张

6 显色剂B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1个

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成应再次离心。

3.尿液：用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。

5.培养细胞:检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

6.组织标本:切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂,用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

7．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

8．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

40pg/ml 5号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液

20pg/ml 4号标准品 150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液

10pg/ml 3号标准品 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液

5pg/ml 2号标准品 150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液

2.5pg/ml 1号标准品 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行