DB35T 1555-2016水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒 多重RT-PCR 检测方法.docxVIP

ICS65.020.01

B16

DB35

福建省地方标准

DB35/T1555—2016

水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒

多重RT-PCR检测方法

MultiplexRT-PCRMethodofNarcissusyellowstripevirus,Narcissusmosaicvirusand

Narcissuslatentvirus

2016-07-06实施2016-04-06

2016-07-06实施

福建省质量技术监督局

DB35/T1555—2016

本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》给岀的规则编写。本标准由福建岀入境检验检疫局提岀并归口。

本标准起草单位：福建岀入境检验检疫局、福建农林大学。

本标准主要起草人：沈建国、高芳銮、金晶、李敏、虞赞、陈细红、陈寿铃。

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水仙黄条病毒水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒多重RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒的多重RT-PCR检测方法。

本标准适用于水仙鳞球茎、植株中水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒的多重RT-PCR检测。

2规范性文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

SN/T2122进岀境植物及植物产品检疫抽样方法

SN/T2964植物病毒检测规范

SN/T3457植物病毒分子生物学检测规范

3有害生物基本信息

参见附录A。

4原理

水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒分子生物学特性是多重RT-PCR检测的主要依据。

5仪器设备和主要试一剤

1仪器设备

高速冷冻离心机、电子天平（1/1000g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、-20°C低温冰箱和-80°C超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台等。

5.2主要试剂

多重RT-PCR检测试剂见附录B。

6抽样和样品制备

1抽样

抽样方法按照SN/T2122中规定执行，尽可能抽取有病毒危害症状的材料，水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒的危害症状描述参见附录A。

6.2样品制备

分别按照有症状和无症状进行样品制备，具体方法按照SN/T2964和SN/T3457中规定执行。

7多重RT-PCR

具体方法见附录B。

8序列测定

PCR产物纯化、回收后，进行克隆、测序，或者直接测序。利用美国国立生物技术信息中心（NCBI网站上的BLAST软件把测序所得到的核苷酸序列与已知的相应病毒序列进行比对，同源性达到95%以上,则判定为该病毒序列。

9结果判定

9.19.2

9.1

9.2

9.3

9.4

当RT-PCR检测结果呈阳性,当RT-PCR检测结果呈阳性,当RT-PCR检测结果呈阳性,当RT-PCR检测结果呈阴性,

测定的序列为水仙黄条病毒序列测定的序列为水仙花叶病毒序列测定的序列为水仙潜隐病毒序列则判定为未检岀对应目的条带大小的病毒。

则判定为检岀水仙黄条病毒。则判定为检岀水仙花叶病毒。则判定为检岀水仙潜隐病毒。

10结果判样品保存

经检测，结果判定为阳性的样品应保存在-20。或-80。冰箱中，并作好登记和标记工作，以备复核用。

11记录

记录好各项实验数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。分子生物学物测始果保留电泳照片，序列测定结果保留测序报告图。

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DB35/T1555—2016附录A

(资料性附录)

水仙黄条病毒、水仙花叶病毒、水仙潜隐病毒的背景资料

A.1分类地位

水仙黄条病毒：

学名：Narcissusyellowstripevirus,缩写：NYSV。

分类地位：马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus。

水仙花叶病毒：

学名：Narcissusmosaicvirus，缩写：NMV。

分类地位：线性病毒科(Flexiviridae)、马铃薯X病毒属(Potexvirus)。

水仙潜隐病毒：

学名：Narcissuslatentvirus，缩写：NLV。

分类地位：马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、柘橙病毒属(Macluravirus)。

A.2寄主范围

NYSV:自然寄主目