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实验三外源基因在大肠杆菌中的诱导表达与检测
2024-01-28
引言
实验材料
实验方法
实验结果
实验讨论
实验总结与展望
目录
contents
引言
01
基因工程的基本原理
通过人工方法将外源基因导入到受体细胞中，并使其在受体细胞中表达，从而生产出所需的产品。
大肠杆菌具有生长快、培养简便、遗传背景清楚等优点，因此常被用作基因工程的受体细胞。
通过添加诱导剂（如IPTG）来诱导外源基因的表达。在大肠杆菌中，常用的诱导剂是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），它可以与阻遏蛋白结合，使其构象发生改变而从DNA上脱落下来，从而解除对结构基因的阻遏作用，使RNA聚合酶能够结合到结构基因上去，启动转录并翻译出相应的蛋白质。
大肠杆菌作为表达系统的优点
诱导表达的原理
实验材料
02
1
2
3
用于克隆和扩增外源基因。
大肠杆菌DH5α
用于构建表达载体，具有卡那霉素抗性基因和T7启动子。
pET-28a质粒
用于与pET-28a质粒连接，构建重组表达载体。
含有目的基因的DNA片段
LB培养基
用于大肠杆菌的培养。
卡那霉素
用于筛选含有pET-28a质粒的转化子。
IPTG
用于诱导外源基因的表达。
SDS相关试剂
用于检测外源基因的表达产物。
03
电泳仪
用于DNA片段和蛋白质的分离。
01
恒温摇床
用于大肠杆菌的培养。
02
超净工作台
用于无菌操作。
凝胶成像系统
分光光度计
离心机
超声波破碎仪
用于观察电泳结果。
用于收集菌体。
用于测定菌液浓度。
用于破碎菌体，释放表达产物。
实验方法
03
通过物理或化学方法破碎菌体，释放胞内蛋白质。
菌体破碎
利用适当的缓冲液和离心技术，提取目的蛋白质。
蛋白质提取
通过层析、电泳等技术，进一步纯化目的蛋白质。
蛋白质纯化
样品处理
将提取的蛋白质样品与上样缓冲液混合，进行煮沸处理。
电泳条件
选择适当的电泳条件和参数，如电压、电流和时间等。
结果观察
通过染色和脱色处理，观察电泳结果，分析目的蛋白质的表达情况。
将电泳后的蛋白质转移到固相支持物上，如硝酸纤维素膜。
蛋白质转移
加入特异性抗体进行孵育，使抗体与目的蛋白质结合。
抗体孵育
加入适当的显色底物，进行显色反应，观察结果并进行分析。
显色反应
实验结果
04
诱导前与诱导后比较
通过比较诱导前和诱导后大肠杆菌样品的SDS电泳图谱，可以观察到明显的蛋白质条带差异。诱导后的样品在特定位置出现新的蛋白质条带，表明外源基因成功表达。
表达量分析
根据电泳图谱中蛋白质条带的深浅和宽窄，可以初步判断外源基因的表达量。条带越深越宽，表示表达量越高。
分子量测定
通过与标准蛋白质Marker的电泳图谱比较，可以大致确定外源基因表达产物的分子量。这对于后续实验设计和结果分析具有重要意义。
特异性检测
01
WesternBlot使用特定抗体与目的蛋白结合，因此可以特异性地检测外源基因的表达产物。通过比较诱导前和诱导后样品的WesternBlot结果，可以观察到明显的特异性条带出现。
表达量分析
02
与SDS电泳类似，WesternBlot结果也可以用于分析外源基因的表达量。通过比较条带的深浅和宽窄，可以进一步确认表达量的高低。
分子量测定
03
WesternBlot同样可以用于测定外源基因表达产物的分子量。通过与标准蛋白质Marker的比较，可以准确地确定目的蛋白的分子量。这对于后续实验设计和结果分析同样具有重要意义。
实验讨论
05
诱导剂浓度
通过调整IPTG浓度，找到最佳诱导表达水平，既要避免浓度过低导致表达量不足，也要防止浓度过高引起的细胞毒性。
诱导时机
选择在对数生长期或稳定期进行诱导，以充分利用细胞资源，提高外源基因表达效率。
培养温度与时间
优化培养条件，如降低温度以减缓蛋白质合成速度，延长诱导时间以增加蛋白质积累量。
亲和层析
利用特异性亲和力将目标蛋白质与杂质分离，如His-tag融合蛋白与Ni-NTA树脂的结合。
离子交换层析
根据蛋白质表面电荷差异进行分离，适用于不同等电点的蛋白质纯化。
凝胶过滤层析
根据分子量大小进行分离，适用于去除小分子杂质或聚合体等大分子污染物。
03
02
01
对照组设置
设置未诱导组、空载体组等对照组，以排除非特异性因素的影响，凸显外源基因表达效果。
数据分析与统计
对实验数据进行科学分析和统计处理，以图表形式直观展示实验结果，便于分析和讨论。
定量分析方法
采用WesternBlot、ELISA等定量分析方法对表达产物进行准确定量，进一步验证实验结果。
重复实验
通过多次重复实验来验证结果的稳定性和可重复性，确保数据准确可靠。
实验总结与展望
06
01
通过PCR扩增目的基因，并成功将其克隆到表达载体上，构建了重组质粒。
成功构建外源基因表达载体
02
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