核酶的作用方式与研究技术进展.pptVIP

小型核酶的催化机制第31页，课件共59页，创作于2023年2月锤头型核酶的催化机理锤头型核酶对切割位点的识别遵守NHH规则（N代表任意核苷酸，H代表A，U或C）。它的催化过程需要二价金属离子（如镁离子）的参与，人们提出两种催化机理：单金属离子催化和双金属离子催化。第32页，课件共59页，创作于2023年2月图5锤头型核酶两种可能的催化机理（a）单金属离子催化；（b）双金属离子催化。单金属离子催化机理如图a，在这个模型中，金属氢氧化物作为广义碱从2’OH接受质子。活化的2’氧作为亲核试剂进攻切割位点的磷酸。双金属离子机理如图b。A位点的金属离子作为路易斯酸（Lewisacid）接受2’氧的电子，使2’OH去质子更容易。B位点的金属离子也作为路易斯酸接受5’氧的电子，使O-P键极化且键合力减弱，从而使氧原子更容易游离出来。第33页，课件共59页，创作于2023年2月HDV核酶的催化机理现在被普遍接受的催化机理如图所示。在基态时金属离子结合于切割位点处未成桥的氧原子上，但是在自切割过程中金属离子脱离了与氧原子的直接联系，转而通过一种远距离的作用力与之作用。另外，底物的5’端序列对切割反应有一定影响。HDV核酶可能的催化机理第34页，课件共59页，创作于2023年2月发夹状核酶的催化机理顺式切割发夹型核酶的底物部分与核酶的其余部分是分离的，底物切割位点必须含有RYN*GUC这样一个序列，R代表嘌呤核苷酸，Y代表嘧啶核苷酸，N可以是任何核苷酸。催化发生时，发夹型核酶通过反式转酯反应于图（b）的箭头处切割底物，产生5’-OH和2’，3’-环磷酸末端。第35页，课件共59页，创作于2023年2月核酶的研究方法为了寻找新的和更高效的Rz和DRz，参照RNA分子进化技术提出了Rz和DRz的离体筛选方法。目前，一般认为Rz和DRz的筛选途径有2种，一种是利用天然的RNA或DNA分子在体外筛选出具酶活性的RNA或DNA分子，另一种是通过人工合成并在体外筛选出具酶活性的小片段的RNA或DNA分子。但是第一种途径，在筛选的过程中具有一定的不准确性，通常不被采用，而第二种途径的筛选过程无以上缺点，是一种被普遍采用的筛选途径。自上世纪90年代初初步建立核酶体外筛选法（通常称作SELEX法）以来，至今已利用这一方法制造出无数自然界尚未发现的核酶，以及脱氧核酶和RNA/DNA嵌合核酶。第36页，课件共59页，创作于2023年2月SELEX技术SELEX技术即指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体(Aptamer)。第37页，课件共59页，创作于2023年2月核酶的应用前景和挑战核酶是一类具有催化活性的小RNA分子，可以特异性地识别并结合目标基因mRNA，使该mRNA断裂失活，从而阻断或降低目标基因的表达，起到基因沉默的作用。此外，核酶不会对细胞基因组产生任何副作用，因此核酶作为一种既安全又有效的分子生物学工具受到越来越多研究者的关注。第38页，课件共59页，创作于2023年2月核酶的应用核酶在植物抗病毒领域的研究核酶在动物疾病治疗中的研究核酶在人类疾病治疗中的研究第39页，课件共59页，创作于2023年2月核酶在植物抗病毒领域的研究第40页，课件共59页，创作于2023年2月抗烟草花叶病毒烟草花叶病毒（TMV）是分布广泛、侵染性很强的一类植物病毒，能感染30个科中的199种植物，在我国严重危害烟草、蔬菜和花卉等植物。近年来，随着人们对核酶研究的不断深入，利用核酶进行抗病毒研究已成为新的热点。许多研究者根据烟草花叶病毒基因组的基本结构，成功设计了针对TMV不同识别位点的核酶，取得令人兴奋的成果。杨建华等（1998）将设计的特异切割烟草花叶病毒RNA的锤头型核酶Rz-2转化烟草原生质体，通过检测TMVc对烟草原生质体的侵染性发现，转基因原生质体中TMV侵染性明显低于未转基因的对照组。第41页，课件共59页，创作于2023年2月抗水稻条纹叶枯病毒水稻条纹叶枯病是水稻的主要病毒病害之一。我国从1964年第1次报道该病发生，至今多次暴发流行，对水稻生产构成严重威胁。引起该病的水稻条纹叶枯病毒（Ricestripevirus，RSV），为一类特殊的单链、多组分RNA病毒。刘力等（1996）根据RSV序列，在分析其分子结构及病理特性的基础上设计合成了特异切割水稻条纹叶枯病毒RNA保守区及病害特异性蛋白（Diseasespecificprotein，DSP）基因的核酶