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透明质酸钠生产工艺方法—提取法

透明质酸的生产工艺主要分为两大类，以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。HA在动物组织中的分布较为广泛，几乎所有的动物组织中均含有HA，只是含量不同。已从下列组织中分离出了HA：结缔组织、脐带、皮肤、人血清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉等，但考虑到原料HA含量的高低、数量的多少和易于取得的程度等成本因素，能够用于生产的原料主要为鸡冠、人的脐带和动物眼球。细菌发酵法是利用某些各属的链球菌在生长繁殖过程中，向胞外分泌以HA为主要成分的荚膜而形成的，与动物组织提取法相比，具有成本低，生产规模受动物原料限制，发酵液HA以游离状态存在，易于分离纯化和形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。各种来源的HA无种属差异，不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的HA，在化学本质和分子结构上是一致的，只是相对分子量有差别。

一、以雄鸡冠为原料的生产工艺

(一)工艺路线

冻鸡冠——鸡冠糊——酶解液——滤液——沉淀——HA中间品——溶液——水相——酶解液——HA-CPC沉淀——解离液——滤液——沉淀——HA精品

(二)工艺过程

(1)提取冻鸡冠解冻后，用绞肉机绞碎，加适量水用胶体磨磨成糊状，每一lkg鸡冠加水8L、氯化钠80g，搅拌加热至90℃，保温10min后，冷却至50℃，用lmol／L氢氧化钠液调PH8．5～9．0，加入适量胰酶，45～50℃保温酶解5～7h，酶解过程中维持PH8．5～9．0。

(2)过滤将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液。

(3)乙醇沉淀和中间品干燥取滤液，调PH6．0～6．5，将滤液加到3倍体积的95％乙醇中，反复倾倒3次，待纤维状沉淀充分上浮后，取出沉淀，用适量乙醇脱水3～5次，放入有五氧化二磷的真空干燥器内干燥，得HA中间品。

(4)氯仿处理将HA中间品溶于0．1mol／L氯化钠溶液中，溶解浓度为O．3％，溶解过程中加少量氯仿防腐。溶解后，调PH4．5～5．0，加入等体积的氯仿搅拌处理2次，静置分出水相。

(5)酶解将不相用稀氢氧化钠溶液调PH7．5，加入适量链霉蛋白酶，37℃酶解4h。

(6)络合沉淀酶解结束后，向酶解液中加入同体积的1％氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，静置，收集HA-CPC络合沉淀。

(7)解离将HA—CPC络合沉淀加入0．4mol／L氯化钠溶液中，搅拌解离5～10h。

(8)过滤解离液先加硅藻土过滤至清，再用0．2um微孔滤膜精滤。

(9)醇沉淀、真空干燥将滤液加至3倍体积的95％乙醇中，反复倾倒3次，取出纤维状HA沉淀，脱水，五氧化二磷真空干燥，得HA精品。

(三)工艺说明与讨论

(1)对原料的预处理，鸡冠应洗净后冷冻储藏。也可用丙酮脱水处理或储存，这样除去大部分脂肪等杂质，以利于后面的分离纯化，但成本加大。

(2)鸡冠绞碎后用胶体磨处理时，注意不要磨得太细，以减少机械剪切力对HA的溶解。磨成糊状后，可先用水提取，过滤除去鸡冠残渣得提取液，然后进行酶解除蛋白质；也可将水提取和蛋白酶水解同时进行。后者的提取效率高，几乎达到完全提取，但是取液中的杂质含量也较高。提取时，加在水中加入1％的氯化钠。加热至90℃可对原料有一定灭菌作用，并使蛋白质热变性，易被蛋白酶解，不可用胃蛋白酶，因胃蛋白酶的最适PH值太低，易导HA与蛋白质分子的结合。提取和酶解时，应注意防腐。

(3)HA的提取液粘度较大，过滤速度较慢，可采用先粗滤后精滤，并加纸浆、硅藻土或活性炭助滤。

(4)醇沉淀是分离提HA、肝素、硫酸软骨素等粘多糖最常用的方法之一，在制备过程中，可多次重复使用，类似于重结晶的作用，每次醇沉淀操作，都使用HA的纯度有所提高。在从水溶液中用甲醇或乙醇沉淀HA或其他粘多糖时，必须有盐的存在，一般在1％左右的氯化钠。沉淀形态有纤维状和无定型粉末状两种形态，纤维状HA容易制成，形态疏松，易于脱水和真空干燥，缺点是使用时，溶解速度慢，若在常温下溶解成x％的水溶液，需要3～7D。制备无定型粉末状沉淀，需控制料液的盐浓度、料液和乙醇的混合速度及搅拌速度等诸多因素，工艺较复杂，但粉末状HA溶解速度快，使用方便。

(5)第一次乙醇沉淀、脱水、真空干燥所得HA产品，可作为化妆品用保湿剂。

(6)上述产品HA进行进一步精制时，可以使用干燥的产品，也可使用乙醇沉淀后未干燥的产品，这样可以缩短生产周期。

(7)氯仿可使蛋白质变性沉淀，利用此作用可除去一部分蛋白质杂质。氯仿处理的另一个重要的作用是除去致炎物质。如细菌内毒素是一种脂多糖，其分子兼具脂溶性和水溶性，在进行氯仿和水的界面，利用这一性质可除去细菌内毒素。另处，加快搅拌速度，可提高氯仿在水中的分散度，极大地扩大氯仿和水的界面面积，提高去除细菌内毒素等致炎物质的