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酶促反应动力学实验报告

杨恩原

实验目的：

观察底物浓度对酶促反应速度的影响

观察抑制剂对酶促反应速度的影响

掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值

实验原理：

一、底物浓度对酶促反应速度的影响

式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[S]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度 Vmax)。底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(Michaelis-Menten方程)即：

式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度

以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。将各点连线，在横轴截当v=Vmax/2时，则Km=[S]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-Burk方程)，则此方程为直角方程，即:

以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。将各点连线，在横轴截

距为-1/Km，据此可算出Km值。

本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[S]的倒数作图，计算出其Km值。

二、抑制剂对酶促反映的影响

凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度

Vmax。本实验选取NaHPO作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。

2 4

实验步骤：

实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响

管号试剂取试管9支，将L

管号

试剂

管号试剂另取9支试管编号，做酶促反应：

管号

试剂

混匀，37℃水浴保温5分钟左右。

加入酶液后立即计时，各管混匀后在37℃准确保温15分钟。

保温结束，立即加入LNaOH ml以中止反应。各管分别加入%4-氨基安替比林ml及％

铁氰化钾 ml。

充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510nm处比色。读取各管吸光度，做记录。(酶活性计算及Km值计算)

实验计算：

在37°C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（ug），

以此计算处各管的酶活性（v）。

以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值。

A

。

0.197

0.227

0.234

。吻290

0.347

0.407

0.471

0.631

V

。

8. 443

9.729

10.029

12+429

14..871

17.443

20+186

27043

1/V

！i

0.118

0.103

0.100

。啊080

0.067

0.057

0.050

0.037

11S

I

1.GOO

l. 400

1200

1..000

0.800

0.600

。霉400

0.200

Y=+,Km=

实验二:抑制剂对酶促反映的影响

管号试剂

管号

试剂

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

0.01mol/L基质

液C:ml)

I

］

1

I

1

2

2

4 1

。

蒸熘水(ml)

4

7

6

5

4

3

4

2

取试管9支，将L基质液稀释成下列不同浓度：

管号试剂另取试管9

管号

试剂

混匀，37℃水浴保温5分钟左右。

加入酶液后立即计时，各管混匀后在37℃准确保温15分钟。

保温结束，立即加入LNaOH ml以中止反应。各管分别加入%4-氨基安替比林ml及％铁氰化钾 ml。

充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510nm处比色。读取各管吸光度，并计算各管酶活性。

实验计算：

以酶活性单位(v)的倒数1/v为纵坐标，以底物浓度[S]的倒数1/S为横坐标，在方格纸上描点，并连接各点，求该酶的Km值并与前面未加入抑制剂时测出的Km值作比较。

Y=+,Km=

实验分析：

通过绘图及分别计算无抑制剂与有抑制剂时酶的Km值，可发现，此抑制剂为竞争性抑制剂。通过绘图发现，其两条以1/v为纵坐