柱色谱法分离甲基橙和亚甲基蓝.docxVIP

柱色谱实验教学中甲基橙和亚甲基蓝的分离和测定方法

柱色谱是色谱分析方法中的一种，由于柱色谱能够较大量地有效分离和提纯有机化合物，所以广泛应用在化学分析，药物研究，天然物质提取，医学研究等领域。在大学有机实验教学中，往往都设有柱色谱实验课。在实验教材中，一般采用中性氧化铝为固定相分离甲基橙和亚甲基蓝的混合物［1京］，但此方法分离的色谱带有扩散现象，影响分离效果;且实验中只有定性观察，不进行定量操作。在本实验中，我们改用硅胶为固定相，选用了新的样品溶剂和洗脱剂，在很大程度上抑制了色带扩散，而且色谱带分明，大大提高了分离效果。在实验中还增加了定量测定的内容，通过计算回收率，可对同学们的实验情况进行评判，使你们能够认真收集分离物质，不断地提出问题，调动了你们做实验的积极性。

1实验材料和方法

1.1材料分光光度计（岛津UV22201），玻璃色谱柱。柱色谱用硅胶（100?140目），甲基橙（指示剂），亚甲基蓝（指示剂），H2O:95%乙醇=1:1（A液），0.2mol-L-1HC1:95%乙醇=1:1（B液）。

1.2甲基橙标准曲线的绘制

用A液做溶剂，配制甲基橙系列标准溶液，在入max=450nm处测得甲基橙吸光度（表1）。

1.3亚甲基蓝标准曲线的绘制

用B液做溶剂，配制亚甲基蓝系列标准溶液，在入max=661nm处测得亚甲基蓝吸光度（表1）。

1.4甲基橙和亚甲基蓝的分离

在玻璃色谱柱（d=1cm，1=10cm）底部用脱脂棉轻轻塞紧，称取4g硅胶于小烧杯中，加入15mL蒸馏水，用玻璃棒调好。在柱中先加入1/2柱高的蒸馏水，打开活塞，在搅动下把糊状硅胶加入柱中，同时调整活塞使流速为1滴/s。当柱中液面将要露出硅胶面时，加入5mL左右的A液，当硅胶面又将要露出时，关紧活塞，用移液管准确加入0.50mL以A液做溶剂的混合液（含甲基橙和亚甲基蓝各为0.400g?L-1）。待此混合液将要渗入柱内时，立即用A液洗脱，此时可以观察到有鲜明的黄、蓝两条色带形成。黄色的甲基橙色带随洗脱剂的加入不断下移，而其顶部蓝色带不移动，当黄色带到达柱底部时，更换接受器，全部收集此黄色带，洗脱时间约10min。此后改用B液做洗脱剂，这时可看到蓝色带开始下移，当亚甲基蓝色带到达底部时，更换接受器，全部收集此蓝色带，洗脱时间约30min。

表1

甲基橙标准曲线数据和亚甲基蓝标准曲线数据

甲基橙

亚甲基蓝

P/mg-

L-1A

p/mg-L-1

A

0.000

0.000

0.000

0.000

1.970

0.165

1.110

0.292

3.939

0.326

1.666

0.420

5.909

0.477

2.221

0.547

7.878

0.635

2.776

0.678

9.848

0.784

3.331

0.799

甲基橙的吸光度浓度方程为A=kP。其中k=0.0804mg-1?L。

亚甲基蓝的吸光度浓度方程为A=kP，其中k=0.2445mg-1?L。

2数据处理

把收集到的甲基橙溶液用A液定容到25mL的容量瓶中，并在450nm处测定吸光度A值，甲基橙的回收率可从下公式计算得到:回收率％=（AX25X10-3）/（km）。其中k=0.0804mg-1?L，m为甲基橙在混合物上样中的实际量（mg）。把收集到的亚甲基蓝溶液用B液定容到100mL的容量瓶中，并在661nm处测定吸光度A值，亚甲基蓝的回收率可从下公式计算得到:回收率％=(AX100X10-3)/(km)。其中k=0.2445mg-1?L,m为亚甲基蓝在混合物上样中的实际量(mg)。

表

2

甲基橙和亚甲基蓝回收率

实验

旦号

甲基橙A

回收率

亚甲基蓝A

回收率

1

0.

629

97.8%

0.476

97.3%

2

0.

628

97.6%

0.474

96.9%

3

0.

630

97.9%

0.478

97.8%

4

0.

633

98.4%

0.476

97.3%

5

0.

62

997.8%

0.479

98.0%

平均值

97.

9%

97.5%

3讨论

柱色谱在分离样品时，一般要求柱高和直径之比是8:1。分离同样量的甲基橙和亚甲基蓝混合物需中性氧化铝6g［1］采用本实验方法需硅胶4g就能达到同样的分离效果。

在进行此实验前，需把待分离的混合物甲基橙和亚甲基蓝溶于溶剂中，下面是它们的结构式：

可以看到，它们结构中既有极性部分，