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断裂点精确定位在平衡易位胚胎染色体分析中的应用

王珺，苟兴庆，王茜怡，王晓红*，张硕

(1.空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心，西安710038；2.复旦大学妇产科医院集爱遗传与不育诊疗中心，上海200011)

染色体平衡易位的新生儿出生率约为1/2000，平衡易位是染色体结构异常中最常见的畸变类型[1-2]。平衡易位患者在生育年龄前通常无明显临床症状，但其生殖细胞在减数分裂过程中会大概率产生多种比例的不平衡配子，精子和卵母细胞结合后无法产生正常的二倍体胚胎，从而导致出现反复性流产、胚胎发育停止、胎儿畸形和晚期新生儿缺陷等不良妊娠结局[3-5]。同时，在胚胎发育过程中由于非姐妹染色体单体之间或同一染色体上含有同源序列的脱氧核糖核酸(DNA)分子，DNA分子间/内重新组合形成同源重组，这些同源重组的存在将会对染色体是否易位的判断造成影响。

在过去几年中，有许多学者尝试使用显微切割和二代测序、等位基因映射识

别、单体型连锁分析(PGH)双端测序和长读长测序来获得平衡易位断裂点的精确定位，随后通过靶向PCR-Sanger测序技术精准定位到断裂点或基于断裂点的单核苷酸多态性(SNP)位点进行连锁分析，鉴定完全正常的胚胎[6-11]。但是，在高度重复和可变易位区域中确定精确断点仍然不稳定且不准确。

本研究针对两例染色体平衡易位携带同胞兄弟，利用基因芯片测序结合荧光强度比(LRR)、B等位频率(BAF)、PGH和基因型识别两对夫妇、男方母亲及胚胎的染色体结构。该方法尽可能缩小断裂点区域，精确判断染色体拷贝数结果，加之对单体型结果的评判，更准确的筛选染色体完全正常的胚胎，为改进并完善染色体结构变异检测技术提供可能。

资料与方法

一、研究对象

本研究中两对平衡易位携带夫妇(夫妇A、B)来自陕西省空军军医大学唐都医院生殖医学中心。详细家系图见图1。患者夫妇A中的男方(Ⅱ4)为哥哥，患者夫妇B中男方(Ⅱ5)为弟弟，兄弟二人均已婚且婚后4年均未行避孕措施，其双方配偶(Ⅱ3和Ⅱ6)于2018年11月因原发性不孕症就诊。细胞遗传学检查发现，两对夫妇中的女方(Ⅱ3和Ⅱ6)均为原发性不孕症，两对夫妇中的男方(Ⅱ4和Ⅱ5)均为平衡易位携带者，染色体平衡易位均为46，XY，t(14；16)(q24；p13.3)，经男方父母核型验证，兄弟二人平衡易位均为母源变异遗传。该两对夫妇签署了知情同意后进行胚胎植入前遗传学诊断(PGD)，该研究方案得到空军军医大学唐都医院伦理委员会的批准。

Ⅱ3(哥哥妻子)和Ⅱ4(哥哥)为夫妇A；Ⅱ5(弟弟)和Ⅱ6(弟弟妻子)为夫妇B图1

平衡易位家系图

二、促排卵和胚胎培养

两对夫妇均采用短效长方案促排卵，当3个主导卵泡直径≥18mm时，肌肉注射250mg人绒毛膜促性腺激(HCG)(艾泽，默克，美国)，36h后经阴道取卵。获卵后经培养39～40h行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)，待胚胎发育到囊胚期116～144h(D5～D6)根据评估标准Gardner[12]评估胚胎质量，所有胚胎冷冻保存。

三、芯片检测

分别抽取两对夫妇及男方母亲(I2)各5ml外周血放入抗凝管(三力医用科技发展有限公司)，并严格按照血液和组织抽提试剂盒(DNeasy，QIAGEN，德国)说明书提取DNA。胚胎发育第5天取其滋养外胚层中5～10个细胞置于0.2mlEP管中，根据胚胎细胞制备试剂盒(REPLI-gSingleCellDNALibraryKit，QIAGEN，德国)说明书裂解细胞，并通过多重置换扩增技术(MDA)进行全基因组扩增(WGA)，在恒温30℃扩增8h，后在65℃条件下灭活3min。扩增过程中设

置阴阳性对照，其中阴性对照为4μl胚胎培养过程中的空白培养液，阳性对照为细胞系(GM16457，科里尔医学研究所NIGMS人类遗传细胞库，美国)分离的5～10个细胞。根据芯片检测试剂盒说明书(IlluminaHumanKaryomap-12DNA

AnalysisKit，Illumina，美国)对分离的DNA和WGA产物进行处理，采用IlluminaHumanKaryomap-12芯片V1.0进行检测，再使用IlluminaiScanBeadArrayReader对其进行扫描。

四、染色体的拷贝数变异(CNV)分析

采用GenomeStudio软件和KaryoStudio软件(Illumina)处理微阵列扫描数据以分析CNV。基于二元高斯分布构建14种LRR和BAF模型，用于识别拷贝数异常的基因组区域[13-14]。在正常样本中，每