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利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展

哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主其优势在于能正确有效地识别

真核蛋白的合成、加工和分泌信号，识别和去除基因中的内含子，再经剪切加工成为成

熟的mRNA，能准确地完成糖基化、磷酸化，形成链内和链间二硫键及蛋白水解等翻译后

加工过程，因而产生的完整抗体和天然抗体一样，具有生物学活性，既可识别抗原又可

激活补体系统。哺乳动物细胞易被重组的DNA转染，经过筛选可得到转化的细胞，具有

遗传稳定性和可重复性．表达的产物分泌到培养基中易于纯化。利用哺乳动物细胞表达

蛋白产物已广泛应用于生物制品工业，如病毒疫苗、抗体、干扰素、免疫调节剂、激素、

和生长因子等的大量制备。

1．哺乳动物细胞宿主的选择

哺乳动物细胞表达外源蛋白最初是将抗体基因重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或

lgG的启动子增强子引导。产生的抗体具有相应的结合能力和数应功能，但表达量很低。

常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠

NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和

蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。COS细胞是进行

外源基因瞬时表达时用途最广的宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入DNA

的量或者采用基因组DNA序列的情况都没有什么限制，便于通过检测表达情况来确证

cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。CHO细胞则利于外

源基目的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生比，是用于真核生

物基因表达软为成功的宿主细胞。已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量较低，

一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平，但大肠

杆菌表达的动物蛋白能进行正确的翻译后加工如糖基化和三维结构的形成，不具有与天

然抗体相似的功能活性，且在人体内易于清除。如果需要表达具有生物学功能的膜蛋白

或分泌型蛋白，例如细胞表面的受体或细胞外的激素和酶，则不能在原棱细胞中表达。

而哺乳动物细胞表达的蛋白则具有天然蛋白的生物学活性。为提高哺乳动物细胞的蛋白

表达量，需选择合适的表达载体和有效的启动子和增强子。

2．载体类型

哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得

稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几

天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。目

前常用的可将目的基因导^哺乳动物细胞表达的病毒载体分为两类：整合型如SV40病毒

载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用Sindbisvirus(SV)、

ScmlikiForestvirus(sFV)和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功

能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物

细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的。载体的选择取决于外源基因的导人方式和其调控

元件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体必须具有如下调控元件：①原核

DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性

基躅，以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。目前采州的哺乳动物细胞表达戟体大

都带有来自pBR322的衍生质粒如pX[3、pBRd和pM[的原核序列；②启动子和增强子；

③剪接信号；④终止信号和poIyA加尾信号。为了将含目的基因的载体导入哺乳动物功

物细胞．还必须加入遗传选择标记。常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、二氢叶酸还

原酶(dh]r)基因、新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因等dhfr还可

作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当培养基中逐新增加氨甲蝶呤(MTX)的浓

度时，随着细胞对MTX抗体的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。据文献报道，在

不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表

达水平。

3．载体元件

外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要是启动子和增强子的强弱以及

它们之间