从大肠杆菌中提取质粒DNA.ppt

从大肠杆菌中提取质粒DNA生药0911黄晶实验流程实验原理实验前准备实验步骤补充事项实验流程大肠杆菌置于LB培养基培养使质粒DNA扩增收集和裂解细菌分离和纯化质粒DNA实验原理质粒独立于染色体外，且游离于细胞质内或整合在细菌染色体中。SDS是一种阴离子表面活性剂能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，释放出质粒DNA和染色体DNA。实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构破坏而变性，由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，在高碱性pH条件下两条互补链不会充分分离，当加入中和缓冲液乙酸钾时变性质粒DNA又恢复到原来的构型；实验原理线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大量蛋白质等可被除去，而质粒DNA留在上清液中。再用异丙醇沉淀，乙醇洗涤，可以除去残留的蛋白质，得到纯化的质粒DNA。实验前准备实验材料：含有质粒DNA的大肠杆菌DH５α实验仪器：塑料离心管架；10,100,1000μＬ移液枪；1.5mＬEP离心管；低温高速离心机一台；无菌工作台；高压锅；玻璃仪器及滴管等。实验前准备试剂准备：LB培养基；pH为8.0的GET缓冲溶液；0.2mol/L的NaOH(含1%SDS）；pH为4.8的乙酸钾溶液；异丙醇溶液及75%乙醇溶液；pH为8.0TE缓冲液实验步骤将大肠杆菌接种于LB固体培养基，37℃培养12h,挑一个菌斑接种在LB液体培养基上，37℃培养12~16h在无菌工作台上取1.5mL菌液加入EP离心管中。10000r/min离心1min,吸干上清液，加入150μLGET缓冲溶液，充分混匀，室温放置10min。实验步骤GET缓冲溶液中的EDTA可除去细胞壁上的钙离子，使溶菌酶更易与细胞壁接触。加入200μL新配制的0.2mol/LNaOH(含1%SDS)，加盖，颠倒2~3次，使之混匀，冰浴5min。SDS可使细胞膜裂解蛋白质变性。实验步骤加入150μL冰冷的pH为4.8乙酸钾溶液，加盖后颠倒数次混匀，冰浴3~5min。乙酸钾沉淀SDS和SDS与蛋白质的混合物，冰浴是为了沉淀完全。加入等体积的异丙醇混匀，室温置5min,12000r/min离心5min,弃去上清液。实验步骤加入200μL无菌蒸馏水溶解，再加入1/2V的7.5mol/LNH4Ac，混匀后水浴3~5min,12000r/min离心5min,取上清。上清液中加入等体积异丙醇或两倍体积无水乙醇，室温置5min,12000r/min离心30min,弃上清。实验步骤沉淀用70%乙醇洗涤一次，EP离心管倒置于吸水纸，除尽乙醇，室温自然干燥。加入20μLTE缓冲液，使DNA充分溶解，置于零下20℃贮存，待用。补充事项质粒DNA的提取以碱裂解法分离，提取，纯化质粒DNA最为常用。碱裂解法适用于小量质粒DNA的提取。LB培养基配方：1L中含有胰蛋白胨10g，NaCL10g,琼脂糖或琼脂15g，用NaOH调至pH为8.0。补充事项pH为8.0GET缓冲液：50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA,25mmol/LTris-HClpH为4.8乙酸钾溶液：60mL5mol/LKAC,11.5ml冰醋酸，28.5mL水。谢谢**