PI染色分析和总结.docx

PI染色

荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是PropidiumIodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。

PI可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色

钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管Calcein

-AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光（激发：490nm，发射：515nm）。因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535nm，发射：617nm）。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545nm激发，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定PI和Calcein-AM的合适浓度。

试剂Calcein-AMPI

用荧光显微镜观察细胞形态

以HeLa细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。１．染色溶液的配制

用1ml无水DMSO溶解1mgCalcein-AM，制备成1mmol/l的Calcein-AM储备液，-20℃下密闭冷冻保存。

用1mlddHO溶解1mgPI，制备成1.5mmol/l的PI储备液（1mgPI/1ml

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HO），-20℃下密闭冷冻保存。

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将Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温。

加10μlCalcein-AM储备液和15μl PI储备液至5mlPBS中配制成染色溶液。

Calcein-AM的终浓度为2μmol／l，PI的终浓度为4μmol／l。

细胞染色

染色HeLa细胞等贴壁细胞时,先用Trypsin-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。

将细胞悬液离心3分钟(1,000rpm)。

去除上清液，加入PBS缓冲液，细胞数量调整至105–106个／ml。再用移液器充分混匀。

由于培养基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用PBS洗涤数次直到完全洗净。

将200μl细胞悬液移至小试管中，加入100μl染色溶液，在37℃下孵育15分钟。

在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。

在荧光显微镜下，先使用490±10nm波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545nm波长激发，能够看到红色的死细胞。

*在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再观察。

*Calcein-AM溶液和PI溶液可以混合在一起染色，也可以分开进行染色，加入的先后顺序没有影响。

7）在荧光显微镜下，先使用490±10nm波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545nm波长激发，能够看到红色的死细胞。

*在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再观察。

*Calcein-AM溶液和PI溶液可以混合在一起染色，也可以分开进行染色，加入的先后顺序没有影响。

染色试剂的最佳浓度

Calcein-AM和PI的最适浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。

通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育

30分钟制备死细胞。

用0.1-10μM的PI溶液对死细胞染色，以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。

用0.1-10μM的Calcein-AM溶液对死细胞染色，以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度。接着用该浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。

注意事项

Calcein-AM的ester部位遇到湿气会分解，使用后请在-20℃下密闭冷冻保存，防止水分进入。Cal