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动物基因工程

（AnimalGeneticEngineering）;主要内容;动物基因工程，原称遗传工程，是应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传性，创造新生物物种，通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术；或指应用现代化的生物科学和遗传学技术，对动物基因进行操纵或改造的科学工程。

基因工程的核心技术是DNA的重组技术，还包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。;第一节

目的基因获取

;1基因组DNA及总RNA的提取

动物DNA的来源（核DNA、线粒体DNA、质粒DNA）

1.血液、毛发、皮屑（口腔上皮细胞）、精液、化石及耳朵等活体组织；

2.固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化

RNA来源：新鲜组织或细胞;DNA提取方法：常规苯酚-氯仿方法、试剂盒方法---；

RNA提取：所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理;2基因文库

基因文库(Genelibrary)包括cDNA文库(cDNAlibrary)和基因组文库(Genomelibrary)。

文库:

cDNA是指以mRNA为模板,经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA。

RT-PCR：反转录PCR（ReverseTranscriptionPCR）;基因组文库

（GenomicDNALibrary）

从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。;3PCR

;PCR反应五要素

引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

TaqDNA聚合酶

1）来自水生栖热菌Thermusaquaticus；2）良好的耐热性；3）Mg2+依赖性；4）无校正功能

PCR反应条件优化：

引物设计：;PCR的类型;多重PCR:是指在一个单一反应中同时扩增多个序列的反应过程，能够节省时间和精力。

定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA

锚定PCR：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的DNA。;巢式PCR：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。

差别显示ＰＣＲ：是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。

;4基因克隆

基因克隆（gene?cloning）：或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。

克隆（clone）：指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。

基因克隆步骤：1)?获得待克隆的DNA片段（基因）；2)目的基因与载体在体外连接；３)重组DNA分子导入宿主细胞；４)筛选、鉴定阳性重组子；５)重组子的扩增与／或表达。;序列测定;*是southern于1975年创建用以鉴定DNA中某一特定的基因片段的技术，也称为Southern印迹（SouthernBlot）。

*通过标记的探针DNA与靶DNA结合，检测目的基因的存在及大小。;原位杂交;Western(印迹)杂交;1重组质粒构建;1)质粒图谱登记号：0052

2)质粒名称：pBudCE4.1

3)来源：Invitrogen

4)用途：真核表达载体

5)详细资料

6)是否可以共享

7)联系方式：PM

;重组质粒的构建过程;3体外表达;*在真核生物细胞中的表达：人工培养肝细胞、上皮细胞;第三节

转基因技术

（Transgenictechnology）;1转基因与转基因动物

转基因超级鼠

1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,