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烟草、烟草种子及烟草制品DNA鉴别检测方法-技术报告

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1引言

目前的烟草及烟草制品鉴别检测技术对样品外观检测依赖性强，对烟叶状态的样品主要

依靠感官和经验进行鉴定[1-3]；对于烟丝、烟沫、烟梗等形态的样品，由于外观检测的局限性，烟草质检机构一般也不出具相关的检测报告；除此之外，目前的鉴别检测技术还易受到外界环境、检测人员主观感受差异、加工条件、烟草组织器官变化及不法分子人为染色加料等因素的影响，鉴别检测的准确性还有待于进一步提高。上述原因造成了烟草质检机构出具的烟丝、烟沫、烟梗等形态样品的鉴别检测报告偏少的局面；烟草种子是烟叶生产的基础物资，是烟叶生产质量保障的最初环节，其质量好坏和稳定对烟叶生产影响重大，因此对其进行鉴别检测意义重大。目前烟草行业无烟草种子/非烟草种子的鉴别方法标准，烟草行业检测人员依靠主观方法从外观很难判定烟草种子/非烟草种子。

2024年1月30日，市场监管总局认可与检验检测监督管理司召集各行业评审组研讨资

质认定管理改革工作，拟推行资质认定清单制，正面清单中只保留国家标准、行业标准、技术规范和国际标准（ISO、IEC、ITU）中的方法，对规范性文件、企标和国外标准、实验室方法等不再作为资质认定依据。本次改革事关行业质检机构的资质认定，涉及到了卷烟、雪茄烟、烟用材料、烟叶及烟丝等产品的鉴别检测工作。Q/CTQTC100《烟草及烟草制品烤烟DNA鉴别检验方法》和Q/CTQTC138《烟草种子烟草与非烟草的DNA鉴别检验方法》属于实验室方法，不在正面清单中。为了保障行业专卖打假打私工作的顺利进行，烟草质检机构应提供有效且权威的技术支撑服务，因此，国家局紧急下达了相关鉴别检测方法行业标准

制定任务。

DNA分子标记技术属于分子生物学研究范畴，是从DNA水平区分不同物种甚至是同一

物种不同个体之间的选择性标记技术[1-4]，以被检样品的DNA序列信息为基础，因此不受样品外观、外界环境、检测人员主观感受差异、加工条件等因素的影响，适宜于在烟草、烟草种子及烟草制品鉴别检测中推广应用。目前DNA分子标记技术已有数十种之多，如限制性片段长度多态性标记（RFLP）[5]、随机扩增多态性标记（RAPD）[6]、序列特异性扩增区域标记（SCAR）[7]、内含子长度多态性标记（ILP）[8]、单核苷酸多态性（SNP）[9]、简单序列重复标记（SSR）[10]等。由于在DNA分子水平，不同物种间甚至是同一物种不同个体之间都能得到很好的区分，因此DNA分子标记技术作为物种分类鉴定的一种手段，已被广泛地应用

于属间、种间、品种间的分类鉴定和亲缘关系研究中，几乎可以对所有的生物种类进行分类

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鉴定[11-19]，在目前物种鉴定技术中发展最快，也最为热门。表1列出了DNA分子标记技术在

各类鉴定中的应用。

考虑到烟草与非烟草、烤烟与非烤烟的鉴定对于烟草、烟草种子及烟草制品检测工作的

重要性，优先进行了相关的研究工作：从美国国立生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI）下载已有的烟草基因组数据，分别从各类型烟草的基因组中，筛选出扩增长度适宜的、所有可能的SSR，将相关的引物分别与其它茄科植物和不同类别烟草基因组进行比对，挑选比对不上的引物，作为可能的特异引物（57对引物），最终筛选得到4个DNA分子（SSR-1、SSR-2、SSR-3、SSR-4）标记作为实验验证特异性分子标记的基础；在前期工作中，已完成这4个标记的可靠性实验验证（SSR-1、SSR-2用于烟草与非烟草鉴定，SSR-3、SSR-4用于烤烟与非烤烟鉴定）。在部分烟草制品的鉴别检测中，烟草DNA是否是外加（外源）的，对相关案件的审判有着很大的影响，因此在本方法的研究中，又进

行了外源性烟草DNA的洗脱实验，力图对待检样品的DNA来源做出科学而准确的判断。

表1DNA分子标记技术在各类鉴定中的应用

DNA分子标记技

术类型

应用领域

参考文献

RFLP

法医学鉴定，食品鉴定，中药材鉴定

[14,15,16]

SNP

法医学鉴定

[17]

SSR

动物种类鉴定，中药材鉴定，亲子鉴

定

[18,19,20]

RAPD

作物育种鉴定

[21]

SCAR

作物育种鉴定

[22]

ILP

玉米、水稻等作物品种鉴定

[23,24]

2材料与方法

2.1材料、试剂和仪器

K326、红花大金元、翠碧1号、云烟85、云烟97、云烟201、KRK26、NC297