高效液相色谱法测定饮料中山梨酸和苯甲酸.docxVIP

卫生化学实验七

高效液相色谱法（HPLC）测定饮料中山梨酸和苯甲酸

一、实验目的与要求

1、掌握高效液相色谱法测定饮料中苯甲酸和山梨酸的原理和方法

2、了解高效液相色谱仪的基本结构和使用方法

3、熟悉饮料样品的处理方法

二、实验方法与原理

苯甲酸和山梨酸广泛用于食品防腐剂，能够引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏等。因此国家严格限制其使用量。在本实验中，样品首先经过超声和加热除去二氧化碳和乙醇，然后过滤注入高效液相色谱仪，经反相C18液相色谱柱分离后，紫外检测器230nm波长处检测。以色谱峰的保留时间定性，色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行定量分析。

三、实验仪器与试剂

1、仪器：高效液相色谱仪（Waters，美国）：2487紫外检测器、1525高压输液系统、717进样系统、WatersBreeze色谱工作站；超声震荡仪；100ml烧杯（1个）；

1ml和100μl移液枪；离心管若干个；离心管架；微孔滤膜（0.22μm）。2、试剂：

甲醇（色谱纯）；醋酸铵溶液（0.02mol/L，色谱纯）；流动相分别超声脱气（10min）

山梨酸储备溶液(1.0mg/ml）：准确称取0.2500g山梨酸，加超纯水定容至250ml。

苯甲酸储备液（1.0mg/ml）：准确称取0.2500g苯甲酸，加超纯水定容至250ml。

四、实验步骤

1、样品处理

碳酸饮料（雪碧）：吸取10ml碳酸溶液超声5min，然后用微孔滤膜（0.22μm）过滤，滤液备用。吸取100μl滤液于离心管中，并加入900μl超纯水，混合均匀标记为样品。

2、配制标准溶液

取一定量的苯甲酸储备液，经滤膜过滤于离心管中。吸取滤液50μl于另一离心管并加入950μl超纯水，得到50μg/ml的苯甲酸标准品，做好标记。

同理得到50μg/ml的山梨酸标准品，做好标记。

混合标准品配制：分别吸取500μl过滤后的苯甲酸和山梨酸储备液于离心管中混合均匀，得到500μg/ml的混合标准品。吸取50μl混合标准品（500

μg/ml）于离心管中并加入950μl超纯水，得到25μg/ml的混合样，标记为混标。

3、色谱条件：

色谱柱：C18反相键合色谱柱

流动相：甲醇-0.02mol/L醋酸铵溶液（5:95）流速：1ml/min检测波长：230nm进样量10μl

4、标准品和样品测定

分别进苯甲酸（50μg/ml）、山梨酸（50μg/ml）标准品，确定保留时间。

记录混合标准品（25μg/ml）的峰面积并按下式计算样品中苯甲酸和山梨酸含量：

计算方法：Cx=F×Cs×Ax÷As

式中：Cx—为样品中被测物的含量（μg/ml）；Cs—为苯甲酸或山梨酸标准品的含量（μg/ml）。F—为稀释倍数；Ax—样品的峰面积；As—标准品的峰面积。

五、实验数据记录及结果计算

1、苯甲酸、山梨酸标准品的保留时间

物质

苯甲酸

山梨酸

保留时间（min）

6.780

9.152

2、混合标准品及样品的峰面积

物质

苯甲酸

山梨酸

苯甲酸

样品

山梨酸

峰面积（mAU*min）

386576

2067181

234426

3107

3、实验结果计算

根据公式：Cx=F×Cs×Ax÷As计算得：

C苯甲酸=10×25×234426÷386576

=151.6μg/ml

C山梨酸=10×25×3107÷2067181

=0.375μg/ml

雪碧中含有151.6μg/ml的苯甲酸，0.375μg/ml的山梨酸。

六、注意事项

1、如果被测溶液含有气泡，对测定和仪器的使用均有影响，因此需要将被测溶液超声加热除去二氧化碳。

2、苯甲酸的灵敏波长为230nm，山梨酸的灵敏波长为254nm，在此波长测定

时苯甲酸的灵敏度较低。因此波长选择230nm。

3、平衡前用甲醇：水（5:95）冲洗柱子15min，再用甲醇-0.02mol/L醋酸铵溶液（5:95）

进行平衡。

4、开机顺序：高压输液系统、进样系统、柱温箱、检测器、电脑软件。

、使用盐做流动相的时候：水：甲醇=95:5冲洗柱子20min以上；然后用甲醇冲洗色谱柱20min以上，保存色谱柱。

、关机：清洗结束后，点击并将泵流量输入为0，等压力降为0时，关掉泵电源，退出Breeze工作站，再关闭仪器各部分电源及计算机。

7、注意在移液枪加完一种试剂之后，一定要记得换枪头