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分子标记——AFLP原理和操作步骤

一、原理

AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。但AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增,然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳,多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接,连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。实验中,根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物,可以达到选择性扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段,进行结合,导致特异性扩增。

基因组DNA用两种限制性内切酶进行双酶切，形成分子量大小不等的限制性酶切片段，然后把酶切片段与有共同粘性末端的人工接头连接，连接后的粘性末端序列和接头序列作为PCR反应引物的结合位点，通过PCR反应对酶切片段进行预扩增和选择性扩增。由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3’端加入1-3

二、实验试剂

Taq酶，限制性内切酶EcoRI、MseI，EcoRI接头、MseI接头，E+A引物，M+C引物，T4DNALigase酶，M引物、E引物，过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺、dNTPs、二甲苯兰（FF）、冰醋酸、剥离硅烷、亲和硅烷、50bpMarker，无菌去离子水（本实验用Mix