CR技术原理及其应用-刘晓雪.ppt

编辑课件ppt*********************************PCR技术应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他……*穆利斯(KaryMullis)，美国化学家。1944年生于美国加里福尼亚州的拉霍亚。穆利斯于1985年发明了聚合酶链式反应(PolymeraseChaimReaction，PCR)。这是一项用于扩增脱氧核糖核酸(DNA)技术，反应两小时可使目标DNA扩增106-107倍。由于PCR方法简便，一个初学者略加培训，即可在两周左右完成一些常规的基因扩增实验。PCR创建后，迅速在医学临床，法医鉴定，古生物基因分析和生物工程等方面广泛应用。由于穆利斯创造发明了上述新的生物学研究方法，对生物学的发展作出了突出贡献，而获得了1993年诺贝尔化学奖，获奖时年49岁。同年获奖的还有史密斯。此时，穆利斯在美国加州一家公司任董事长。穆利斯的发明，有一个偶然的闪念起了很大作用。那是在1983年某日的深夜，猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。1985年发明得以实现，不仅获得了诺贝尔奖金，还荣获了日本颁发的LLLLLLLLLLLLLL.P;.,45万美元的奖金。穆利斯发明的PCR从20世纪80年代末开始用来扩增特定的DNA片段，此法也称“基因放大”，它在21世纪也将是遗传工程的研究热点。穆利斯也随之闻名世界。史密斯传略******************************基因mRNA蛋白质多肽链mRNAcDNA杂化双链逆转录酶ＤＮＡ聚合酶PCR扩增4）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳头瘤病毒的分型;单纯疱疹病毒的分型;杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等.多重PCR的特点①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体.②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.5）LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物5’端进行标记,用以直观地检测目的基因。与常规PCR相比更为直观，省去了限制性内切酶酶切及分子杂交等繁琐步骤，而且可同时检测多种基因成分特别适合大量临床标本的基因诊断目前该方法只对PCR产物进行定性鉴定。标记引物ＰＣＲ观察PCR产物ＰＣＲ6）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）主要用于分析具有可变末端的DNA序列锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增带有PolyG尾巴的引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明A-PCR不对任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位抗体基因的研究。cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC7）原位ＰＣＲ原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达