疏水层析相互作用.ppt

根据分离阶段的不同，流速也不一样。如在平衡、洗涤、再平衡的过程中可以稍微提高流速；在上样和线性洗脱或时建议使用低流速，以免流穿或分离不开。（2）.流速（3）.上样量第31页,共41页，2024年2月25日，星期天三、应用蛋白类（包括酶）、肽类的分离钙调蛋白的纯化疏水作用层析法纯化抗乙肝病毒核心抗原单克隆抗体第32页,共41页，2024年2月25日，星期天牛皮层骨中纯化酸性磷酸酶：ABCD（A）CM-Sepharose阳离子交换层析，（B）磷酸纤维素亲和层析，（C）SephacrylS-200凝胶过滤层析，（D）Phenyl-Sepharose疏水作用层析第33页,共41页，2024年2月25日，星期天钙调蛋白纯化过程1.除去填料中的乙醇后，以50%（m/v）浓度悬于10mmol/LTris-HclPH8.0,1mmol/LMgCL2，2mmol/LEDTA,1mmol/Lａ-巯基乙醇（E液）---50mmol/LNacl,1mmol/L尿素的溶液中;2.层析柱（2.5cm*10cm，装40ml填料）：用3-5个CV的10mmol/LTris-HclPH8.0,1mmol/LMgCL2，2mmol/LEDTA,1mmol/Lａ-巯基乙醇（F液），进行平衡；3.将离子交换层析分离好的钙调蛋白，用F液透析后，补加固体CaCl2于样品（终浓度为1mmol/L,，确保钙离子处于饱和状态，并有效的与固定相结合），接着上样；4.用2-4CV的含0.2mol/LNaCl的F液进行洗脱，以除去吸附力弱的杂质及与钙调蛋白结合的一些蛋白；5.用含0.2mol/LNaCl的E液进行洗脱，使有效成分解离（EDTA对Ca2+有较大的亲和力，Mg2+可置换柱中Ca2+）；6.即可得到较为纯的鸡胗钙调蛋白。钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端有两个Ca2+结构域,每个结构域可以结合一个Ca2+,这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+,钙调蛋白与Ca2+结合后的构型相当稳定。苯基-SepharoseCL-4B第34页,共41页，2024年2月25日，星期天疏水作用层析法纯化抗乙肝病毒核心抗原单克隆抗体目的:采用疏水作用层析法纯化小鼠腹水来源的抗乙肝核心抗原(HBcAg)单克隆抗体(mAb),并对分离条件进行优化。方法:采用不同疏水层析介质、溶液pH和NaCl浓度,研究其对抗体吸附的影响,以及分析不同的洗脱方式和洗脱体积对抗体洗脱的影响,并用ELISA法检测纯化后抗体的活性。结果:疏水作用层析法纯化小鼠腹水来源的抗HB2cAgmAb(IgG1)的最适条件是以pH7.0、20mmol/LPB+1.2mol/L(NH4)2SO4为上样缓冲液,采用1.2～0mol/L(NH4)2SO4,12CV梯度进行洗脱,获得的mAb纯度大于75%,回收率达80%,纯化后mAb的活性保持良好。结论:采用疏水作用层析对mAb进行纯化,并优化了各步实验条件,为建立具有抗体纯度高、生物学活性好、易于放大的抗HBcAg的mAb的纯化方法提供了必要的实验基础第35页,共41页，2024年2月25日，星期天近年来，随着层析技术的发展，与HIC相关的其它层析技术也得到了发展，主要有以下两种：1）亲硫性疏水层析(thio—philicchromatography)2）疏水电荷诱导层析(HCIC)四、发展趋势第36页,共41页，2024年2月25日，星期天1）亲硫性疏水层析

(thio—philicchromatography)该技术主要在疏水作用的基础上增加了硫元素的相互作用。利用层析介质与含硫蛋白质和非硫蛋白质的亲硫性差异，对蛋白质加以分离。具体应用条件和HIC类似。通常这类介质通过硫醚键将配基和基质联接，如Butyl—S-Sepharose6FastFlow，已用于乙肝病毒表面抗原的分离纯化第37页,共41页，2024年2月25日，星期天2）疏水电荷诱导层析(HCIC)HCIC是近几年来发展起来的一类不同于HIC的新技术，由Burton等1998年提出；HCIC与蛋白质的作用除了疏水作用，还有电荷间的相互作用；HCIC与蛋白质的结合是由疏水作用推动的，与HIC不同的是，这一过程通常是在不改变离子强度的条件下实现的；洗脱时也不像HIC那样通过改变盐的浓度