QPCR实验报告_原创精品文档.pdfVIP

q-pcr实验流程

一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打

开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，rna抽提

需带口罩。③取ep管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完ep管/枪头

后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，

移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤

实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。二、总rna抽提

1）细胞培养皿中细胞样品用1*pbs洗两次后，用1ml枪将pbs吸干净，加入1mltrizol

（invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5mlrnasefreeep管中使细胞充分裂解，室温

静置5min；

组织样品用液氮充分研磨，加入1mltrizol（invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min

使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，

使水相和有机相充分接触，室温

静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与

第一步的顺序一致）

3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，rna在上层水相，移至另一个新的rnase

freeep管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头

不可碰到、吸到中间层）4）沉淀rna：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8应

用振荡器混匀），室温静置10min；

5）4℃下，14,000g离心10min，收集rna底部有沉淀，应将ep管放置在-80度冰箱过

夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集rna沉淀），去上清；

6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min倒ep管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打

沉淀），超净台风干；沉淀不

能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量depc水（至

少15ul）溶解沉淀。三、去基因组

使用rnase-free的dnase?（promega），按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃

灭活10min。

rnadnase?10xbufferh2o(rnasefree)rnasin总

体积

然后按以下步骤操作：

1)加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，

离心15min，取上清。

2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，

取上清。

3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），-20℃静置15min；4）4℃下，

14,000g离心15min，收集rna沉淀，去上清；5）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min），

超净台风干；6）加入适量depc水（至少15ul）溶解沉淀。

四、总rna纯度和完整性检测

1）纯度检测：取1μlrna样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定od值，od260/od280

的比值大于1.8，说明制备的rna较纯，无蛋白质污染。2）总rna完整性检测：取rna样

品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80v×20min，eb染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总

rna的5srrna，18srrna和28srrna条带，三条条带完整的话即可证明总rna抽提比较

完整。

五、逆转录1.mrna：

1)在rnasefree的pcr管中配置下列溶液.